大鼠蛛網膜下腔出血后MMP－9在基底動脈壁中的表達變化

黨寶齊 陳 罡 王 中

基質金屬蛋白酶（matrix metallop roteinases，MMPs）是一組具有蛋白水解活性的半胱氨酸蛋白酶，有相似的功能特性。MMP－9 是MMPs家族中明膠酶的一種，目前研究表明MMP－9 參與多種神經系統疾病的發生、發展［1～3］，近年來，研究認為MMP－9與蛛網膜下腔出血后發生的早期腦損傷（early brain injury，EB I）關 系 密 切［3，4］，但 它 與SAH 后血管壁痙攣的關系尚無報道。本實驗利用大鼠枕大池一次注血法制得SAH 動物模型，應用常規HE染色及免疫組化等方法觀察基底動脈管壁形態及MMP－9 分子在管壁上的表達變化，探討MMP－9在CVS 的發生中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

成年健康雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠51只，體重250～300 g，由蘇州大學醫學院實驗動物研究中心提供。大鼠隨機分為正常組（6只）、對照組（假注血組15只）和SAH 組（30只），其中對照組和SAH 組分 為1、3、5、7、14 d 5 個 亞 組，對 照 組 和SAH 組每個亞組分別為3 只、5 只大鼠。Rabbit Anti－MMP－9購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.2 SAH 模型的制作

將SD 大鼠用10%水合氯醛（4 ml／kg）腹腔麻醉成功后，俯臥固定于操作臺上，在左右耳根連線可摸到枕外隆凸，往下大約0.5 cm 可感覺一凹陷，在此處沿中線縱行剪開項部皮膚，上至枕外隆凸，長約1.5 cm，向內鈍性逐層分離皮下軟組織及項部肌群，暴露寰枕筋膜后碘伏棉球覆蓋傷口；翻轉大鼠，使其仰臥位，解剖大鼠腹側部尾動脈，不抗凝下抽取動脈血0.35 ml，l ml注射器針頭緊貼枕骨大孔下緣穿刺寰枕筋膜，見有清亮腦脊液流出，在1～2 min的時間內按0.3 ml自體不抗凝動脈血注入枕大池，注血后穿刺點壓迫3 min，縫合切口；與水平面30°保持頭低位30 min以上，使血液向蛛網膜下腔流動；大鼠保溫復蘇至清醒后自由飲食飲水。假注血組以等容積生理鹽水代替自體血注入枕大池，對應實驗組相應時間點處死取材。正常組為正常大鼠，未作任何處理。

1.3 大鼠的處死方法及標本留取

各組大鼠在不同時間分批次以10%水合氯醛麻醉后開胸，先剪開右心耳，并結扎降主動脈，然后開放生理鹽水200～300 ml以100cmH2O 的壓力進行快速灌注，排出全身血液直至右心耳流出液體清亮；再以4%中性多聚甲醛200～300 ml灌注，至大鼠四肢抽搐，變硬；灌注完畢后迅速開顱完整取出腦標本；置于4%多聚甲醛溶液中固定（4℃）24 h 后經液體石蠟包埋待測。

1.4 大鼠基底動脈的取材和HE染色

將標本分離出基底動脈和腦干后，常規石蠟包埋。于基底動脈的3個層面切取標本作HE 染色，基底動脈頂端下1mm，基底動脈中段，基底動脈底端上1mm 處，連續切片，片厚5μm。光鏡下觀察基底動脈的形態學變化。用顯微鏡計算機圖像分析系統（Image－Proplus專業圖像分析軟件）計算血管截面的內徑及其壁厚。通過基底動脈內徑比較，判斷血管有無痙攣及痙攣程度。CVS 值參照Liszczak法［5］，計算如下：CVS值＝（注血前BA 直徑一注血后BA 直徑）／注血前BA 直徑×100%。CVS的評價方法，參照Handa 方法：無CVS 為CVS 值≤10%；輕度CVS為CVS值11%～30%；中度CVS為CVS 值31%～50%；重 度CVS 為CVS 值≥50%。

1.5 基底動脈壁MMP－9的免疫組化檢測

石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（0.01 M，pH 7.5±0.1）沖洗3次，每次3 min；pH6.0檸檬酸緩沖液高溫高壓修復，每張切片加1 滴或50 ul過氧化酶阻斷溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性；PBS 沖洗3 次，每次3 min，除去PBS液，每張切片加1滴或50 ul正常非免疫動物血清，室溫下孵育10 min，除去血清，每張切片分別加1滴1∶100稀釋的Rabbit Anti－MMP－9，室溫下孵育60 min；PBS沖洗3次，每次3～5 min；除去PBS液，每張切片加1滴或50 ul生物素標記的第二抗體，室溫下孵育10 min；PBS 沖洗3次，每次3 min；除去PBS 液，每張切片加1滴或50 ul鏈霉素抗生物素－過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min；PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS液，每張切片加2滴或100 ul新鮮配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察3～10min；自來水沖洗，蘇木素復染，PBS 沖洗返藍；判斷標準：陽性染色為棕色或棕黃色。高倍鏡（10×20）下觀察每個血管壁內膜、中膜及外膜的染色情況，以無染色為陰性（－），輕度或局部染色為（＋），全層重度或強烈染色為（＋＋＋），介于兩者之間為（＋＋）。

1.6 統計學處理

數據用均數±標準差（ˉx±S）表示，采用SPSS 13.0軟件。多組比較用單因素方差分析（one way ANOVA），兩兩比較在總體方差齊的條件下選用LSD 及Dunnett法進行分析。P＜0.05為有統計學意義，P＜0.01為統計學差異顯著。

2 結 果

2.1 大體觀察

正常組及對照組大鼠腦表面及血管周圍均未見到積血，對照組也未見手術損傷；SAH 組l d 時可見在腦干腹側、基底池、顱底腦表面明顯積血，血塊分布均勻；3 d時與SAH1d相比，蛛網膜下腔的積血吸收明顯減少，但腦干腹側仍可見少量殘余積血，切開標本，側腦室內仍可見少量積血；5 d 時蛛網膜下腔積血基本吸收，腦表面未見積血，可見輕度黃染；7 d 時蛛網膜下腔積血已吸收，腦表面見輕度黃染；14 d 時腦表面基本未見明顯異常。

2.2 基底動脈HE 染色

2.2.1 形態學

光鏡下正常組和對照組的基底動脈結構正常，呈橢圓形，管腔光滑，管壁較薄，內膜完整，內皮細胞無壞死脫落，排列平整，結構層次清楚，內彈力層平整，血管平滑肌呈扁平狀。SAH1 d～7 d組均可見基底動脈結構不同程度改變，即血管壁增厚，管腔狹小，結構紊亂，內皮細胞變形、腫脹，內彈力膜迂曲皺折，厚薄不均，部分中膜變厚，平滑肌細胞排列紊亂，細胞外間質增多，內膜下及外膜可見炎細胞浸潤，14 d 組基底動脈結構未見明顯改變。

2.2.2 管壁厚度的變化

與相應對照組比較，SAH l、3、5 d 組血管壁有不同程度的增厚（P＜0.01），其中3 d 組最為明顯，約為對照組的1.7倍；14 d時管壁厚度基本正常（表1及圖1）。

2.2.3 血管腔內徑的變化

與對照組比較，SAH l、3、5 d組管腔內徑明顯減小（P＜0.01），其中3d組的管腔狹窄最為明顯（表1及圖2）。通過計算CVS 值，評價各組CVS程度，l、5 d 時CVS 值 分 別 為11.56±2.50，16.25±4.14，表 現 為 輕 度CVS；3 d 時CVS 值 為32.98±2.87，表現為中度CVS；7、14 d時CVS值分別為5.68±1.70，0.99±3.28，表現為無CVS（表1及圖2）。

圖1 各組大鼠基底動脈厚度的變化

圖2 各組大鼠基底動脈內徑的變化

表1 各組大鼠基底動脈內徑、動脈壁厚度（±s）以及CVS程度的比較

表1 各組大鼠基底動脈內徑、動脈壁厚度（±s）以及CVS程度的比較

注：與正常組相比較，▲P＜0.01，△P＜0.05；與對應時間點對照組比較，★P＜0.01，☆P＜0.05；與SAH 組1，5，7，14 d比較，●P＜0.01

組別 n 動脈壁厚度（μm） 動脈內徑（μm） CVS值（%） CVS 程度正常組 6 9.93±1.02 284.41±16.44－ －對照組1 d 3 9.23±0.30 291.59±13.22 － －對照組3 d 3 10.16±0.20 286.67±8.91 － －對照組5 d 3 11.38±0.15 299.83±10.22 － －對照組7 d 3 8.98±0.53 286.16±13.30 － －對照組14 d 3 9.36±0.74 286.76±5.35 － －SAH 組1 d 6 12.02±1.06▲★ 250.76±7.59▲★ 11.56±2.50 輕度SAH 組3 d 6 17.90±1.54▲★● 190.61±8.94▲★● 32.98±2.87 中度SAH 組5 d 6 13.33±1.15▲☆ 238.20±12.89▲★ 16.25±4.14 輕度SAH 組7 d 6 12.12±1.63△☆ 268.25±5.31△☆ 5.68±1.70 無SAH 組14 d 6 10.75±1.36 281.58±10.22 0.99±3.28無

2.3 MMP－9在基底動脈上的表達變化

免疫組化結果顯示正常組的基底動脈壁的中膜層上僅在局部有極微弱的染色信號，內膜層、外膜層未見染色；在SAH1d 血管壁已有較明顯免疫染色信號，主要在中膜及內膜，外膜也可見到散在的染色信號；在SAH3d 則在中膜及內膜下有強烈的免疫染色，外膜可見中度染色；在SAH5d，SAH7d時染色信號開始減弱；SAH14d已基本恢復正常（表2）。

表2 大鼠基底動脈壁MMP－9的表達水平

3 討 論

自發性SAH 是具有高病死率和高病殘率的臨床危重癥，主要是由顱內動脈瘤破裂引起。據統計，每年每100000中約10人會發生顱內動脈瘤破裂引起SAH［6］。再出血和腦血管痙攣是SAH 后患者死亡和病殘的兩大主要原因。通過術前鎮靜，控制血壓，積極的開顱手術夾閉和介入栓塞治療可以較好地控制顱內動脈瘤再破裂出血。腦血管痙攣的發生率約為30%～70%，其中30%左右的患者可引起腦缺血癥狀，部分患者可致嚴重的腦梗死。CVS發病機制尚未明確，現考慮主要為兩個方面共同作用的結果：腦血管收縮作用的增強和舒張作用的減弱。氧和血紅蛋白的氧化產物和內皮素均影響鈣離子通道的活性，升高細胞內鈣離子的水平，使平滑肌細胞收縮增強，氧和血紅蛋白還可以活化PKC 和RHO激酶使平滑肌細胞收縮增強，同時它還可以抑制NO 合成酶，滅活NO，引起NO 水平下降，導致血管舒張作用減弱。同時有研究表明SAH 后血管平滑肌和成肌纖維細胞增殖，同時伴有細胞壞死及血管壁重構，SAH 后內皮的增生和膠原的沉積、纖維化［7］，提示SAH 后動脈壁出現增厚和順應性下降也可能是腦血管舒張作用減弱的原因。動脈瘤性蛛網膜下腔出血后血管壁發生了器質性病理變化，伴隨蛛網膜下腔出血的免疫炎性反應、血管壁細胞增殖與凋亡導致的血管壁損害可能是腦血管痙攣的關鍵病理途徑。近年來發現基質金屬蛋白酶－9 與腦血管病關系密切，MMP－9 可降解細胞外基質（extracellular matrixc，ECM），參與結締組織的降解和重建、炎性反應和缺血缺氧損傷等病理過程，在顱內動脈瘤相關病理過程中發揮重要作用。最近Mc－Girt等［8］研究發現SAH 后血清血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、MMP－9和血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）濃度能有效預測遲發性CVS 的 發 生［8］，Solveig等研究發現SAH 后患者血清中MMP－9水平升高，存在血管痙攣的患者血清MMP－9 水平更高［9］，提示MMP－9 與CVS的發生發展可能有關系。但有關SAH 后MMP－9水平與SAH 后血管痙攣的關系尚未見報道。

本研究結果顯示SAH 后基底動脈壁MMP－9表達上調，3～5 d表達持續在一個較高的水平，隨后開始下降，14 d基本恢復正常，與腦血管痙攣發生時相基本一致，提示MMP－9在SAH 后CVS 的發病機制中可能起著非常重要的作用。

目前MMP－9與動脈瘤性SAH 的研究大多集中在SAH 后早期腦損傷方面，MMP－9可能通過降解層粘連蛋白參與早期腦損傷［10］，但MMP－9與動脈瘤性SAH 后CVS 的關系報道很少。本研究結果顯示基質金屬蛋白酶－9可能在SAH 后遲發性腦血管痙攣中發揮作用，MMP－9可能參與了CVS的病理過程。其可能機制為MMP－9通過降解腦血管周圍基膜主要成分IV，V 型明膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等參與細胞凋亡引起血管壁的病理性器質性變化，使腦血管壁增厚，順應性下降，從而使血管的舒張性減弱，血管痙攣。但其究竟如何引起腦血管痙攣目前尚不太清楚，需進一步研究。

1 YamaguchiM，Jadhav V，ObenausA，et al.Matrix metalloproteinase inhibition attenuates brain edema in an in vivo model of surgically－induced brain injury.Neurosurgery，2007，61（5）：1067－1076.

2 Caird J，Napoli C，Taggart C，et al.Matrixmetallop roteinases 2 and 9 in human atherosclerotic and non－atherosclerotic cerebral aneurysms.Eur J Neurol，2006，13（10）：1098－1105.

3 Zongduo Guo，Xiaochuan Sun，Zhaohui He，et al.Role of matrix metalloproteinase－9 in apoptosis of hippocampal neurons in rats during early brain injury after subarachnoid hemorrhage.Neurol Sci，2010，31（2）：143－149.

4 Zongduo Guo，Xiaochuan Sun，Zhaohui He，et al.Matrix metalloproteinase－9 potentiates early brain injury after subarachnoid hemorrhage.Neurological Research，2010，32（7）：715－720.

5 Liszezak TM，Varsos VG，Back PM，et al.Cerebral arterial contraction after experimental subarachnoid hemorraghe is associated with blood components within the arterial wall.Neurosurg，1983，58（1）：18－25.

6 Pfohman M，Criddle LM.Epidemiology of intracranial aneurysm and subarachnoid hemorrhage.J Neurosci Nurs，2001，33（1）：39－41.

7 Megyesi JF.Findlay JM.In vivo animal models of Cerebral vasospasm：a review.Acta Neurochirurgica－Supplement，2001，77：99－102.

8 McGirt MJ，Lynch JR，Blessing R，et al.Serum von Willebrand Factor，matrix metalloproteinase－9，and vascular endothelial growth factor levels predict the onset of cerebral vasospasm after aneurysmal subarachnoid hemorhage.Neurosurg，2002，51（5）：1128－1135.

9 Horstmann S，Su Y，Koziol J，et al.MMP－2 and MMP－9levels in peripheral blood after subarachnoid hemorrhage.J Neurol Sci，2006，251（1－2）：82－86.

10 Zongduo Guo，Xiaochuan Sun，Zhaohui He，et al.Matrix metalloproteinase－9 potentiates early brain injury after subarachnoid hemorrhage.Neurological Research，2010，32（7）：715－720.