一種地衣芽孢桿菌表達載體的構建

歐陽文 劉 軍* 李俊輝

(1、武漢工業學院 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2、華中農大浦城綠康生物工程研究所，湖北 武漢 430070)

一種地衣芽孢桿菌表達載體的構建

歐陽文1劉 軍1*李俊輝2

(1、武漢工業學院 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；2、華中農大浦城綠康生物工程研究所，湖北 武漢 430070)

用PCR方法從地衣芽孢桿菌WH-08基因組DNA中分別擴增α-淀粉酶基因amyL啟動子PamyL和終止子TT，用重疊PCR技術將兩者連接，重疊PCR產物用Hind III和EcoR I雙酶切后，與經相同酶切的載體PHY300 PLK連接，構建重組質粒PHY-PamyL-TT。該重組載體的構建為外源蛋白在地衣芽孢桿菌中的高效表達奠定了基礎。

地衣芽孢桿菌；重疊PCR；表達載體

芽孢桿菌具有良好的分泌特性，其發酵工藝和產物回收技術也較成熟，用作外源蛋白的分泌型宿主菌，具有很大的潛力[1]。以往主要以枯草芽孢桿菌表達外源蛋白，但研究發現，地衣芽孢桿菌作為蛋白表達宿主有較多優勢。地衣芽孢 桿菌是一種革蘭氏陽性的腐生性微生物，廣泛分布于土壤和其它自然環境中，具有耐熱，酶系豐富，產酶量高，安全等諸多優良特性，是芽孢桿菌中較具應用潛力的菌種之一。與枯草芽孢桿菌相比，地衣芽孢桿菌生長溫度高，不僅能節省生產能源，而且也使某些酶對結合在胞壁上的蛋白酶敏感性降低；其次，其生長速率適中，容易使剛跨膜的未合適折疊的蛋白充分折疊[2]。作為高表達外源基因的宿主細胞，地衣芽孢桿菌提供了外源基因高效穩定的細胞微環境，表達產物較穩定，適合大規模工業化生產目的，且在酶產量方面，其比枯草芽孢桿菌更具優勢，有成為生產工業用酶宿主菌的巨大潛力。

啟動子是基因表達調控的重要順式元件，也是基因工程表達載體的一個重要元件，適宜啟動子的選擇是重組蛋白高效表達的關鍵因素之一。地衣芽孢桿菌具有較強向胞外分泌α-淀粉酶的能力。一般來說，高效表達的基因往往具有較強的啟動子。牛丹丹等[3]利用地衣芽孢桿菌自身啟動子PamyL，構建表達載體在地衣芽孢桿菌中實現了α-淀粉酶基因的高效表達。本研究通過利用重疊PCR技術從地衣芽孢桿菌基因組中分別擴增α-淀粉酶基因amyL啟動子PamyL和終止子TT，構建重組質粒PHY-PamyL-TT，為外源蛋白在地衣芽孢桿菌中的高效表達奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質粒 地衣芽孢桿菌WH-08，克隆載體PHY300PLK，均為本實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑 各種限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、PyrobestTMDNA Polymerase、DNA Marker DL2000均購自TaKaRa公司；PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 啟動子PamyL的擴增

根據amyL基因啟動子PamyL序列設計引物：上游引物P1：5'-ATGCAAGCTTGTCGAC ATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'(引物引入Hind III和Sal I酶切位點，用下劃線標注），下游引物P2：5'-AGATCTTCTAGAGGATCCGGTACCGAGCTC AAGATTTGCCGCCGCTGC-3'(下劃線標注多克隆位點MCS)，以地衣芽孢桿菌WH-08基因組DNA為模板，PCR擴增啟動子PamyL。PCR反應參數：94℃預變性5min，94℃變性1min→51℃退火1min→72℃延伸1min (30 個循環)，72℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用PCR回收試劑盒回收，作為重疊PCR的模板。

1.2.2 終止子TT的擴增

根據amyL基因終止子TT序列，設計引物：上游引物P3：5'-

GAGCTCGGTACCGGATCCTCTAGAAGATCT GATAGAAGAGCAGAGAGGA-3'(下劃線標注多克隆位點MCS：

SacⅠ-KpnⅠ-BamHⅠ-XbaⅠ-BglⅡ),下游引物P4: 5'-GAATTCCCGGGACTAGTGCATGCGGCCGC GATCACCCGC

GATACCG-3'(下劃線標注多克隆位點MCS：EcoRⅠ-SmaⅠ- SpeⅠ- SphⅠ - NotⅠ)，以地衣芽孢桿菌WH-08基因組為模板，

PCR擴增amyL基因終止子TT。PCR反應參數：94℃預變性5min，94℃變性1min→51℃退火 1min→72℃延伸1min(30 個循環)，

72℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用PCR回收試劑盒回收，作為重疊PCR的模板。

1.2.3 啟動子PamyL和終止子TT的連接

采用重疊PCR的方法，將回收的啟動子PamyL和終止子TT混合，做為擴增的模板，加入P1和P4作為PCR擴增引物。PCR反應參數：94℃預變性5min，94℃變性1min→51℃退火 1min→72℃延伸1min (30個循環)，72℃延伸10 min。擴增產物用PCR回收試劑盒回收。

1.2.4 重組質粒PHY-PamyL-TT的構建

回收重疊PCR產物，用Hind III和EcoR I雙酶切后，與經相同酶切的載體PHY300 PLK連接，構建重組質粒PHY-PamyL-TT，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆。提取陽性克隆質粒，經Hind III和EcoR I雙酶切鑒定后，測序分析。

2 結果與討論

2.1 啟動子PamyL的擴增

提取地衣芽孢桿菌WH-08基因組，PCR擴增amyL基因啟動子PamyL，結果見圖1，擴增產物與啟動子PamyL大小相符（約280bp）。

圖1 PCR擴增啟動子PamyLM：DL2000核酸標準分子量；1~3：PCR擴增產物

2.2 終止子TT的擴增

提取地衣芽孢桿菌WH-08基因組，PCR擴增amyL基因終止子TT，結果見圖2，擴增產物與終止子TT大小相符（約280bp）。

圖2 PCR擴增終止子TTM：DL2000核酸標準分子量；1~3：PCR擴增產物

2.3 重疊PCR連接啟動子PamyL和終止子TT

以回收的啟動子PamyL和終止子TT混合物做為擴增的模板，通過重疊PCR方法，將PamyL和終止子TT連接起來。結果見圖3。擴增產物大小與預計相符，在550bp處可見擴增條帶。

圖3 重疊PCR擴增M：DL2000核酸標準分子量：1~3：重疊PCR擴增產物

2.4 重組質粒PHY-PamyL-TT的構建與鑒定

重組質粒構建過程見圖4。用Hind III和EcoR I酶切重疊PCR產物，連接到經同樣雙酶切的PHY300PLK上，構建重組質粒PHY-PamyL-TT。重組質粒經Hind III和EcoR I雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見在4800bp和550bp處兩條帶，分別與質粒PHY300PLK以及重疊片段大小相符，見圖5。測序結果表明，重組表達載體PHY-PamyL-TT構建成功。

圖4 重組質粒PHY-PamyL-TT的構建

圖5 重組質粒酶切鑒定M： DL2000核酸標準分子量；1：經Hind III和EcoR I雙酶切的重組質粒PHY-PamyL-TT；2： 質粒PHY300PLK； 3: 重疊PCR擴增產物

本研究通過利用重疊PCR技術從地衣芽孢桿菌WH-08基因組中分別擴增啟動子PamyL和終止子TT，構建重組質粒PHY-PamyL-TT，內含兩個多克隆位點，方便基因的插入，為外源蛋白在地衣芽孢桿菌中的高效表達奠定了基礎。

[1]Simonen M, Palva I.Protein secretion in Bacillus species [J].Microbiol Mol Biol Rev. 1993 , 57(1): 109-137.

[2]牛丹丹,石貴陽,王正祥.分泌高效蛋白的地衣芽孢桿菌及其工業應用[J].生物技術通報,2009,(6): 45-50.

[3]牛丹丹,徐敏,王正祥,等.地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的克隆及其啟動子功能鑒定[J].微生物學報,2006, 46(4): 576-580.

Q2-3

A

1673-2219（2011）12-0024-03

2011－09－25

歐陽文（1985－），湖北仙桃人，碩士研究生，主要從事應用微生物與生物技術研究。

通迅作者：劉軍(1966－)，副教授，湖北南漳人，主要從事應用微生物與生物技術研究。

(責任編校：何俊華)