胰十二指腸同源框因子-1聯合細胞因子誘導人臍帶間充質干細胞分化為胰島β樣細胞的研究

王博 吳漢青 吳河水 王春友

·論著·

胰十二指腸同源框因子-1聯合細胞因子誘導人臍帶間充質干細胞分化為胰島β樣細胞的研究

王博 吳漢青 吳河水 王春友

目的探討人臍帶間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)體外誘導分化為胰島β樣細胞的方法。方法用含胰十二指腸同源框因子-1基因(pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX1)重組腺病毒(Adxsi-CMV-PDX1)感染人臍帶MSCs，再聯合多種細胞因子進行誘導分化。應用RT-PCR、免疫熒光染色法檢測誘導后細胞的PDX1、胰島素(insulin)、神經元素3(ngn3)、葡萄糖轉運體2(glut2)、NK轉錄因子6.1(NKX6.1)mRNA的表達；化學發光法檢測誘導后細胞培養上清中胰島素和C肽的分泌量；流式細胞儀檢測胰島素陽性細胞率。結果Adxsi-CMV-PDX1感染臍帶MSCs并聯合細胞因子誘導后，細胞從短梭形變成長梭形，并聚集形成胰島樣細胞團，經雙硫腙染成亮紅色。誘導17 d后的細胞表達PDX1、ngn3、NKX6.1、insulin、glut-2的mRNA；細胞胞質內有胰島素和C肽；細胞培養上清中胰島素和C肽含量分別為(473.1±51.5)mU/L和(1.61±0.41)ng/ml，用25 mmol/L高糖刺激1 h后，胰島素和C肽分泌量高達(964.4±68.1)mU/L和(3.72±1.52) ng/ml；胰島素陽性細胞率達(11.6±4.8)%。結論PDX1轉入臍帶MSCs后，聯合細胞因子在體外能夠誘導其分化為胰島β樣細胞，胰島素和C肽分泌水平較高，且對高糖刺激有反應，但還不是完全成熟的β細胞。

臍帶； 間質干細胞； 胰腺十二指腸同源框因子-1； 胰島β樣細胞； 細胞分化

胰島移植為糖尿病治療帶來了曙光，但是由于供體有限、移植后易引起免疫排斥反應、移植細胞的數量難以控制等問題限制了其臨床應用。最近的研究報道，胚胎干細胞和成體干細胞都可以分化為胰島素分泌細胞[1-2]，但誘導效率和胰島素分泌水平低下，不能滿足臨床治療需要。胰十二指腸同源框因子-1(pancreatic and duodenal homeobox factor 1，PDX1)是胰腺發生和胰島發育的一個重要調節基因，在胚胎發育過程中促進胰腺的早期發育和晚期β細胞分化，成體中維持β細胞的形態和功能[3]。Kajiyama等[4]和Hisanaga等[5]分別以PDX1、細胞因子誘導骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化為胰島素分泌細胞，但胰島素分泌水平均低下。因此，本研究聯合應用PDX1及細胞因子誘導MSCs，觀察其誘導效率及胰島素分泌量。

材料與方法

一、人臍帶間充質干細胞的分離、培養及鑒定

無菌取健康胎兒4～5 cm臍帶， PBS洗滌后剪成約1 mm3組織塊，膠原酶Ⅳ消化、過網后收集細胞濾液，離心、洗滌后置含10%FBS的DMEM/F12常規培養6～7 d，棄未貼壁細胞，3～4 d 換液1次。待細胞達80%融合后，按1∶3的比例傳代。取第4代細胞，以(1～2)×106/ml的細胞懸液分裝6管，每管0.1 ml，分別加入鼠抗人抗體CD45-PE、CD34-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC、鼠IgG-FITC+IgG-PE，室溫孵育30 min后流式細胞儀檢測。

二、臍帶MSCs的誘導

第4代MSCs培養達70%～80%融合時分為4組：含熒光蛋白GFP的重組腺病毒Adxsi-CMV-PDX1(本所保存)+細胞因子組(聯合組)、Adxsi-CMV-PDX1組、空病毒+細胞因子組和對照組。病毒感染MSCs 7 d后，先聯合應用100 ng/ml人表皮生長因子(EGF)+2% B27誘導3 d，再聯合應用10 ng/ml胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、10 ng/ml人β細胞調節素(β-cellulin)、10 ng/ml肝細胞生長因子(HGF)、10 mmol/L煙酰胺(NIC)、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、2% B27，在含5% FBS的DMEM/F12中誘導7 d。對照組僅常規培養。用雙硫腙行細胞染色。

三、MSCs感染后PDX1表達的檢測

取Adxsi-CMV-PDX1感染7 d的MSCs，行細胞爬片，取片行常規免疫熒光法檢測PDX1的表達。

四、誘導后細胞胰島素和C肽表達的檢測

取各組誘導后細胞行爬片培養，常規免疫熒光法檢測細胞胰島素及C肽的表達。兔抗人胰島素多抗購自美國Abcam公司。

五、胰島素相關基因NKX6.1、insulin、glut2、ngn3 mRNA及PDX1 mRNA檢測

抽提各組細胞總RNA，采用RT-PCR檢測各基因mRNA的表達。引物應用Primer5.0軟件設計，由上海英駿生物技術公司合成。NKX6.1上游5′-CCATCTTCTGGCCCGGAGT-3′，下游5′-CGGACG-CGTGCAGTAGGAG-3′，擴增片段480 bp，退火溫度55℃；insulin上游5′-AACCAACACCTGTGCGGC-TCA-3′，下游5′ -TGCCTGCGGGCTGCGTCTA-3′，擴增片段271 bp，退火溫度60℃；glut-2上游5′-GCGAATAAACAGGCAGGAGC-3′，下游5′-GCTGGATACAGACAGGGACC-3′ ，擴增片段392 bp，退火溫度53℃；ngn3上游5′-AAAGCGAGTTGGCACTAAGCA-3′，下游5′-CGTCTGGGAAGGTGGGAAGTA-3′，擴增片段132 bp，退火溫度57℃；PDX-1上游，5′-GGATGAAGTCTACCAAAGCTCACGC-3′，下游5′-CCAGATCTTGATGTGTCTCTCGGTC-3′，擴增片段230 bp，退火溫度60℃；內參GAPDH上游5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′，下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，擴增片段285 bp，退火溫度58℃。

六、胰島素與C肽分泌量測定

取各組細胞培養液上清置-20℃保存待測。取誘導后胰島樣細胞團，洗滌2次后置無血清H-DMEM(含25 mmol/L葡萄糖)孵育1 h，取上清，置-20℃保存。采用化學發光法測定胰島素和C肽含量，試劑盒均購自美國Abbott Axsym System公司。實驗重復5次。

七、胰島素陽性細胞率檢測

取誘導第17天的細胞，胰蛋白酶消化、PBS洗滌后加insulin-Cy5，流式細胞儀計數105個細胞，測定胰島素陽性細胞率。

八、統計學處理

結 果

一、人臍帶MSCs的形態和表面標志表達

單個核細胞培養48～72 h內開始貼壁，細胞呈短梭形、多角形；7 d內大部分細胞貼壁，呈短梭形；培養15 d接近80%融合，呈長梭形。傳到第4代時細胞形態均一，CD29+、CD44+細胞分別占98.7%和99.6%，而CD45+、CD34+、 HLADR+細胞僅分別占2.3%、1.6%和0.68%(圖1)。

圖1 第4代臍帶MSCs的形態及表面標志表達

二、重組病毒感染后MSCs的PDX1表達

感染72 h后臍帶MSCs表達GFP(圖2a)，感染率約90%。外源基因PDX1定位于細胞核(圖2b、c)。

圖2 重組病毒感染MSCs 7 d后GFP(a)及PDX1(b、c)表達

三、臍帶MSCs的誘導分化

重組病毒感染后聯合EGF、B27培養，細胞由長梭形逐漸變圓，相鄰細胞開始聚集，形成一個個由圓形或卵圓形細胞組成的細胞團，形如胰島小體樣結構，再聯合其他因子培養后，細胞聚集更緊密(圖3a)，經雙硫腙染成亮紅色(圖3b)；胞質內C肽被染成綠色(圖3c)； insulin被染成紅色(圖3d)。

圖3MSCs誘導后細胞的形態(a、b)及C肽(c)、胰島素(d)表達(免疫熒光 ×400)

四、胰島相關基因mRNA的表達

聯合組細胞在誘導0、7、10、17 d和17 d加高糖刺激1 h后均可檢測到胰島相關基因PDX1、ngn3、insulin、glut-2、NKX6.1 mRNA的表達(圖4)。

圖4 誘導后細胞胰島相關基因mRNA的表達(RT-PCR)

五、胰島素和C肽的分泌

Adxsi-CMV-PDX1組、空病毒+細胞因子組及對照組細胞培養不同時間及用高糖刺激，其胰島素分泌量均無明顯變化，波動在(3.6±2.4)mU/L～(4.5±3.7)mU/L。聯合組細胞誘導第10、17天時，培養液上清中胰島素含量顯著升高，高糖刺激1 h后，胰島素的分泌量更高(表1)。

只有聯合組在培養第10、17天表達C肽，分別為(0.13±0.04)ng/ml和(1.61±0.41)ng/ml，高糖刺激后C肽分泌高達(3.72±1.52)ng/ml，其他時段及其他各組細胞的培養上清液中均未檢測到C肽，差異顯著(P<0.05)。

表1 各組細胞各時段培養液上清中胰島素分泌量(X±SD, mU/L)

注：與其他組相比，aP<0.05

六、胰島素陽性細胞率

聯合組胰島素陽性細胞率為(11.6±4.8)%，對照組為0。兩組差異有統計學意義(P<0.05)。

討 論

Kaneto等[6]報道，PDX1不能誘導MSCs表達胰島素mRNA。本實驗單獨用攜帶PDX1的重組腺病毒感染臍帶MSCs 17 d也未能檢測到胰島素mRNA。最新研究[7-10]已經明確，從β前體細胞到成熟β細胞的發育過程除需PDX1之外，尚需NKX6.1、ngn3、Mafa、NKX2.2、Foxa1等轉錄因子的時序表達、相互作用，此外，許多細胞因子也可以促進這一分化過程[11-13]。

本實驗結果顯示，PDX1轉入MSCs 7 d后僅有ngn3 mRNA表達，聯合EGF與B27刺激3 d后，激活臍帶MSCs向β細胞定向分化所需的NKX6.1的表達，并啟動了胰島素mRNA的表達，細胞形狀與β細胞非常相似。經雙硫腙染成亮紅色，說明誘導后的MSCs細胞的胞質內富含鋅離子,具備β細胞前體細胞的特征。再聯合其他因子誘導后細胞的胰島素水平和C肽分泌水平顯著升高，高糖刺激后胰島素分泌量更高，C肽分泌量也增加，glut2 mRNA也開始表達。

insulin、glut2、GK和Mafa是β細胞成熟的4個重要標志物，而ngn3在成熟的β細胞中并不表達。本實驗誘導的胰島樣細胞表達insulin、glut2和ngn3 mRNA，說明誘導的β細胞尚未完全成熟。有研究報道，轉入外源性PDX1、ngn3和Mafa 3個基因可以將成年鼠胰腺外分泌細胞分化為胰島β樣細胞，胰島素陽性細胞百分率可達20%[14]。因此，要提高誘導效率，還需要進一步優化誘導方案。

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2010-07-26)

(本文編輯：屠振興)

PDX1geneandcytokinesinducehumanumbilicalcordmesenchymalstemcellstodifferentiateintoisletβ-likecellsinvitro

WANGBo,WUHan-qing,WUHe-shui,WANGChun-you.

DepartmentofPancreaticSurgery,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

WUHe-shui,Email:heshuiwu@163.com

ObjectiveTo explore the method how PDX1 gene modified mesenchymal stem cells (MSCs) from human umbilical cord can be differentiated into islet β-like cells in vitro.MethodsRecombined adenovirus vectors inserted with PDX1 (Adxsi-CMV-PDX1) was transfected into MSCs and multiple cytokines was combined to induce differentiation. The expressions of PDX1, insulin, ngn3, glut2, NKX6.1 were examined by RT-PCR and immunofluorescence staining. The levels of insulin and C peptide secretion were examined by chemiluminescence immunoassay. Flow cytometry was used to determine the positive rate of insulin cells.ResultsAfter Adxsi-CMV-PDX1 transfection and cytokines induction, MSCs were transformed from short spindle shape to long spindle shape and aggregated into islet-like cell clusters. Dithizone staining of these cells showed bright red color. PDX1, ngn3, NKX6.1, insulin, glut 2 mRNA were expressed in cells 17d after induction. Insulin and C peptide were expressed in cytoplasm. The levels of insulin and C peptide in cell culture supernatant were (473.1±51.5)mU/L and (1.61±0.41)ng/ml; the levels of insulin and C peptide secretion were (964.4±68.1)mU/L, (3.72±1.52) ng/mL, respectively, with 25 mmol/L glucose stimulation for one hour. Insulin (+) cells rate (11.6±4.8)%.ConclusionsAdxsi-CMV-PDX1 combined with cytokines can induce MSCs from human umbilical cord to differentiate into islet β-like cells. They can secret insulin and C peptide, and have the sensitivity to the stimulation of glucose.

Umbilical cord; Mesenchymal stem cells; Pancreatic and duodenal homeobox factor;Islet β-like cells; Cell differentiation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.015

430022 湖北武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院胰腺外科

吳河水，Email:heshuiwu@163.com