12-脂氧合酶在胰腺癌中的表達及其臨床意義

龔鐳 胥明 彭曉斌 唐學軍 朱穎偉 陸健

·論著·

12-脂氧合酶在胰腺癌中的表達及其臨床意義

龔鐳 胥明 彭曉斌 唐學軍 朱穎偉 陸健

目的檢測胰腺癌組織和胰腺癌細胞株SW1990和PANC1的12-脂氧合酶(12-lipooxygenase,12-LOX)表達,探討其與胰腺癌臨床病理參數的關系。方法分別應用免疫組化染色、RT-PCR和蛋白質印跡法檢測胰腺癌組織、癌旁正常胰腺組織及胰腺癌細胞株SW1990和PANC1中12-LOX mRNA 和蛋白的表達。分析胰腺癌組織12-LOX表達與臨床病理參數的相關性。結果30例胰腺癌組織12-LOX表達陰性8例，弱陽性7例，強陽性15例,總陽性率為73.3%。SW1990和PANC1細胞均表達12-LOX。陽性表達的胰腺癌組織及兩株胰腺癌細胞株均表達12-LOX mRNA，而癌旁正常胰腺組織不表達12-LOX mRNA及蛋白。胰腺癌組織12-LOX強陽性表達與腫瘤TNM分期、腫瘤病理分級和淋巴結轉移相關(P<0.05)，而與患者年齡、性別無關。結論12-LOX在胰腺癌中表達上調，與胰腺癌的惡性生物學行為有關。

胰腺腫瘤； 12-脂氧合酶； 病理學； 免疫組織化學； 逆轉錄聚合酶鏈反應

脂質代謝紊亂是腫瘤發生的主要機制之一。既往研究發現，胰腺癌組織環氧合酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)表達增高，且與TNM分期明顯相關[1]。脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)是另一類與脂質代謝相關的酶類，目前發現有5-LOX、8-LOX、12-LOX和15-LOX 4種亞型。文獻報道5-LOX表達與胰腺癌的發生密切相關[2]。本研究檢測胰腺癌組織及細胞株中12-LOX的表達，分析其與臨床特征之間的關系。

材料與方法

一、實驗材料

收集本院手術切除的30例胰腺癌標本(男23例，女7例，平均年齡66歲)和9例癌旁正常胰腺組織。胰腺癌細胞株SW1990和PANC1由第二軍醫大學附屬長海醫院惠贈。RT-PCR試劑盒購自Gibco公司。兔抗人12-LOX單抗購自abcam公司，HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自長島公司。生物素標記羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司。

二、方法

1．免疫組化染色：胰腺癌組織石蠟切片，常規行免疫組化染色。12-LOX單抗工作濃度1∶100，以PBS代替一抗作為陰性對照。陽性染色表現為胞質內出現棕黃色顆粒。參考Krajewska等[3]的標準在高倍鏡下隨機觀察5個視野，按陽性細胞比例將0、1%～25%、26%～50%、51%～75%、≥76%分別計0～4分；按染色強度將無、黃色、棕黃色、棕褐色分別計為0～3分，最后綜合兩者得分。如某片有25%黃色(1×1=1)、50%棕黃色(2×2=4)及25%棕褐色(1×3=3)，則總分為1+4+3=8。0分為陰性，1～5分為弱陽性，≥6分為強陽性。

2．RT-PCR：取液氮凍存新鮮胰腺組織及2×107個胰腺癌細胞，按照說明書提取細胞總RNA，常規行RT-PCR。12-LOX引物序列：上游5′-GGCCCG-GACCCAACTCATCTC-3′，下游5′-GGCTTAGGGACC-CAGGCATACCAG-3′，擴增片段465 bp；內參GAPDH引物序列：上游5′-GTGAAGGTCGAGTCAACC-3′，下游5′-GGTGAAGACGCCAGTGGACTC-3′，擴增片段223 bp。退火溫度為60℃。

3．蛋白質印跡法：取5例強陽性及3例弱陽性胰腺癌組織50 mg或2×107個胰腺癌細胞，加入4℃預冷的胞質蛋白提取液1 ml[10 mmol/L HEPES，10 mmol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF，10 μg/ml aprotinin、pepstatin、leupetin，50 mmol/L NaF，1 mmol/L NaVO4，20 mmol/L對硝基苯磷酸]勻漿，4℃ 2000 r/min離心30 s，取上清并加入50 μl 10% NP-40于4℃ 5000 r/min離心1 min，收集上清-80℃保存備用。常規行蛋白質印跡法檢測12-LOX蛋白表達。兔抗人12-LOX單抗1∶600稀釋。最后ECL顯色。

三、統計學處理

應用SPSS13.0軟件分析。12-LOX表達與臨床病理資料間關系用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、胰腺癌組織12-LOX的表達

30例胰腺癌組織12-LOX表達陰性8例，弱陽性7例，強陽性15例。癌旁正常胰腺中的胰腺導管內皮細胞及腺泡細胞均為陰性，部分胰島細胞呈弱陽性染色(圖1)。

圖1胰腺癌組織(a)和癌旁正常胰腺組織(b)12-LOX的表達(免疫組化 ×200)

二、胰腺癌組織12-LOX表達與臨床病理參數的關系

胰腺癌組織12-LOX強陽性表達與TNM分期、腫瘤病理分級和淋巴結轉移相關(P<0.05)，而與患者年齡、性別均無關(表1)。

表1 胰腺癌組織中12-LOX的表達與腫瘤病理參數的關系

三、胰腺癌組織及胰腺癌細胞株12-LOX mRNA表達

陽性表達的胰腺癌組織及胰腺癌細胞株均表達12-LOX mRNA，而癌旁正常胰腺組織未見12-LOX mRNA的表達(圖2)。

1:Marker；2:SW1990；3:PANC1；4、5：胰腺癌組織；6：癌旁正常組織

圖2胰腺癌細胞株、胰腺癌及癌旁正常胰腺組織12-LOX mRNA的表達

四、胰腺組織及胰腺癌細胞株12-LOX蛋白的表達

蛋白質印跡法結果提示，胰腺癌組織和胰腺癌細胞株中均有12-LOX蛋白的高表達，在癌旁正常胰腺組織中也有微量的12-LOX蛋白表達(圖3)。

1：SW1990；2：PANC1；3、4：胰腺癌組織；5、6：癌旁正常胰腺組織

圖3胰腺組織及細胞株中12-LOX的表達(蛋白質印跡法)

討 論

脂氧合酶(LOXs)是不飽和脂肪酸代謝的關鍵酶類之一,可將花生四烯酸(a rachidonic acid, AA)、亞油酸(linoleic acid,LA)及其他多不飽和脂肪酸轉變為有生物活性的代謝產物,從而影響細胞結構、代謝及信號轉導。12-LOX催化AA形成12-HETE，進一步的催化可產生白三烯(leukotriene, LTs)、脂氧素(lipoxin, LXs)、Hepoxilins等生物活性物質。體外研究發現，在胰腺癌組織中12-LOX催化AA形成的12-HETE可通過與12-HETE受體、類固醇受體輔激活因子-1、過氧化物酶體增殖體活化受體(PPARs)、類視黃醇X受體和其余核受體結合,激活多條胞內信號轉導途徑，如激活P44/42有絲分裂原活化蛋白激酶和PI3/AKT 激酶等途徑,促進胰腺癌細胞內DNA合成[4-5]。阻斷12-LOX途徑可明顯抑制胰腺癌細胞增殖和誘導細胞凋亡[6]。進一步研究顯示，12-LOX抑制劑通過減少抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達,誘導Caspase-3、Caspase-9的激活,PPAR的裂解,證實12-LOX抑制劑可誘導胰腺癌凋亡發生[7-8]。

本結果顯示，人胰腺癌組織高表達12-LOX，胰島細胞呈弱陽性表達，而正常的胰腺腺泡細胞和胰管內皮細胞則為陰性。人胰腺癌細胞株SW1990、PANC1亦高表達12-LOX。胰腺癌組織12-LOX的表達與臨床TNM分期、腫瘤病理分級以及淋巴結轉移存在正相關，表明12-LOX參與了胰腺癌的發生及發展過程。

[1] Hermanova M, Karasek P, Tomasek J,et al. Comparative analysis of clinicopathological correlations of cyclooxygenase-2 expression in resectable pancreatic cancer. World J Gastroenterol, 2010,16: 1879-1884.

[2] Tong WG, Ding XZ, Talamonti MS, et al. LTB4 stimulates growth of human pancreatic cancer cells via MAPK and PI-3 kinase pathways. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 335: 949-956.

[3] Krajewska M,Krajewski S,Epstein JI, et al.Immunohistochemical analysis of bcl 2,bax,bcl-X,and mcl-1 expression in prostate cancers.Am J Pathol,1996,148:1567-1576.

[4] Ding XZ, Tong WG, Adrian TE, et al.12-lipoxygenase metabolite 12(S)-HETE stimulates human pancreatic cancer cell proliferation via protein tyrosine phosphorylation and ERK activation. Int J Cancer,2001, 94: 630-636.

[5] Ding XZ, Kuszynski CA,El-Metwally TH,et al. Lipoxygenase inhibitors abolish proliferation of human pancreatic cancer cells.Biochem Biophys Res Commun,1999, 266:392-399.

[6] 趙崧,王興鵬,徐剛,等.脂氧合酶對胰腺癌細胞增殖和凋亡的調節作用.中華消化雜志,2005,25:606-609.

[7] Ding XZ, Kuszynski CA, Adrian TE, et al. Lipoxygenase inhibition induced apoptosis, morphological changes, and carbonic anhydrase expression in human pancreatic cancer cells. Biochem Biophys Res Commun,1999, 266:392-399.

[8] Tong WG, Ding XZ, Adrian TE. The mechanisms of lipoxygenase inhibitor-induced apoptosis in human breast cancer cells.Biochem Biophys Res Commun,2002,296:942-948.

2011-06-17)

(本文編輯：屠振興)

Expressionandclinicalsignificanceoflipoxygenase-12inhumanpancreaticadenocarcinoma

GONGLei,XüMing,PENGXiao-bing,TANGXue-jun,ZHUYing-wei,LUJian.

DepartmentofGastroenterology,WuxiSecondPeople′sHospital,Wuxi214002,China

XüMing,Email:xm73dr@yahoo.com.cn

ObjectivesTo study the expression of lipoxygenase-12(12-LOX) in human pancreatic adenocarcinoma and its relationship with the clinicopathological parameters.MethodsExpression of 12-LOX in pancreatic carcinoma tissue, pancreatic cancer cell lines SW1990 and PANC1, and adjacent normal pancreatic tissue was detected by using immunohistochemistry, RT-PCR, and Western blot, respectively. The relationship between 12-LOX expression and clinicopathological parameters was analyzed.ResultsExpression of 12-LOX was negative in 8 cases, weak positive in 7 cases and strong positive in 15 cases of pancreatic carcinoma. The overall positive rate in pancreatic carcinoma was 73.3%. The expressions of 12-LOX mRNA and protein were positive in pancreatic cancer cell lines SW1990 and PANC1, and negative in adjacent normal pancreatic tissue. The strong positive expression of 12-LOX in pancreatic cancer was associated with TNM stage, pathological grade, lymph node metastasis(P<0.05).ConclusionsThe expression of 12-LOX was up-regulated in pancreatic cancer and is correlated well to malignant behaviors of tumor.

Pancreatic neoplasms； 12-Lipoxygenase； Pathology; Immunohistochemistry; RT-PCR

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.010

214002 無錫，南京醫科大學附屬無錫市第二人民醫院消化內科

胥明，Email:xm73dr@yahoo.com.cn