大黃對急性壞死性胰腺炎大鼠炎性介質(zhì)表達(dá)的影響

金晶 高軍 呂順莉 劉楓 龔燕芳 滿曉華 吳紅玉 李兆申

·論著·

大黃對急性壞死性胰腺炎大鼠炎性介質(zhì)表達(dá)的影響

金晶 高軍 呂順莉 劉楓 龔燕芳 滿曉華 吳紅玉 李兆申

目的觀察中藥生大黃空腸灌注對急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織炎性介質(zhì)表達(dá)的影響。方法SD大鼠33只，按完全隨機(jī)法分為對照組、ANP組及生大黃治療組，每組11只。胰膽管逆行注射3%牛磺膽酸鈉溶液方法制備ANP模型，同時(shí)做空腸造瘺。生大黃組于造模后空腸灌入1 g/ml生大黃煎液1 ml/kg體重。造模36 h后處死大鼠。取血測定淀粉酶活性；取部分胰腺組織常規(guī)病理檢查；取部分胰腺組織抽提總mRNA,采用實(shí)時(shí)PCR方法測定胰腺組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)。結(jié)果造模后大鼠血淀粉酶活性明顯升高，胰腺組織大片壞死、出血，大量炎細(xì)胞浸潤，符合ANP改變。對照組胰腺組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)量分別為0.29±0.13、0.35±0.15、1.09±0.32；ANP組分別為2.23±0.49、2.26±0.51、5.24±0.59，均較對照組顯著增加(P值均<0.05)；生大黃組分別為0.97±0.30、1.02±0.34、2.59±0.36，均較ANP組顯著減少，但仍顯著高于對照組 (P值均<0.05)。結(jié)論生大黃空腸灌注治療ANP大鼠可減少胰腺組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的表達(dá)，從而減輕胰腺的病理損傷。

胰腺炎，急性壞死性； 白細(xì)胞介素6； 白細(xì)胞介素8； 腫瘤壞死因子-α； 大黃

在重癥急性胰腺炎(SAP)早期，給予患者大黃可阻斷胃腸道菌群易位，保護(hù)胃腸黏膜屏障，控制內(nèi)源性感染，維持腸道內(nèi)菌群的生態(tài)平衡，改善腸道黏膜的血液灌流量，減少局部滲出，促進(jìn)炎癥吸收[1]。此外，大黃還可促進(jìn)腸蠕動(dòng)，緩解腸麻痹，有助于膽汁、胰液的引流通暢和膽道炎癥的控制，消除膽源性胰腺炎的病因[2]。但是關(guān)于大黃對SAP治療作用的研究主要集中在臨床療效病例報(bào)道及回顧性分析，而相關(guān)的作用機(jī)制研究較少。本研究觀察生大黃煎液干預(yù)急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠后胰腺組織中IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)的變化，探討大黃治療ANP的作用機(jī)制。

材料與方法

一、材料

健康雄性SD大鼠購自第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級，3～4個(gè)月齡，體重250～300 g。牛黃膽酸鈉購自SIGMA公司，24G一次性留置靜脈針為江蘇碧迪醫(yī)療器械有限公司提供，Trizol購自Invitrogen公司，IL-6、IL-8、TNF-α mRNA引物由上海生工公司合成,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TAKARA公司，熒光定量PCR試劑盒購自TAKARA公司，熒光定量PCR儀器為美國ABI公司產(chǎn)品，生大黃煎液(產(chǎn)地：甘肅)由長海醫(yī)院中藥房煎制，濃度1 g/ml。

二、ANP模型制作及分組

SD大鼠33只，按分層隨機(jī)法分為對照組、ANP組和生大黃灌注組，每組11只。無菌條件下以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉并固定大鼠。于劍突下約3 cm處腹壁正中切口入腹。循胃、十二指腸球及降部暴露胰腺，找到主胰管。以24G靜脈套管針于主胰管對側(cè)腸壁刺入腸腔，稍退出針芯，循乳頭將軟套管穿入胰膽管約0.5 cm，動(dòng)脈夾固定，另于胰膽管上方近肝門處動(dòng)脈夾鉗夾。用微泵將3%牛磺膽酸鈉溶液按30 mg/kg體重、12 ml/h速度注入。完畢后拔除套管針。以直徑2 mm的無菌塑料管于屈氏韌帶遠(yuǎn)端8 cm處斜行穿刺置入行空腸造瘺，由腹壁引出并固定于背部，關(guān)腹。生大黃組模型制作及空腸造瘺同ANP組。對照組開腹只翻動(dòng)十二指腸后關(guān)腹。ANP組術(shù)后經(jīng)造瘺管按1 ml/kg體重勻速灌入蒸餾水，生大黃組灌入1 g/ml生大黃煎液1 ml/kg體重。制模后36 h處死大鼠。

三、方法

1．血淀粉酶測定及胰腺病理學(xué)檢查：大鼠處死前靜脈取血2 ml，分離血清后送實(shí)驗(yàn)診斷科測定血淀粉酶活性。無菌條件下取胰腺組織，部分甲醛固定，常規(guī)病理檢查，部分液氮冷凍后置-80℃保存。

2．IL-6、IL-8、TNF-α mRNA檢測：采用實(shí)時(shí)PCR法檢測。取100 mg冷凍胰腺組織，碾成粉末，用Trizol抽提總RNA。根據(jù)GenBank公布的cDNA序列，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物。IL-6上游引物：5′-AGGCTTCCTTGTGCAAGTGT-3′，下游引物：5′-TGAGTGACACTGCCTTCCTG-3′，產(chǎn)物230 bp；IL-8上游引物：5′-CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA-3′，下游引物：5′-ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC-3′，產(chǎn)物 104 bp；TNF-α上游引物：5′-ACTCCCAGAAAA-GCAAGCAA-3′，下游引物：5′-CGAGCAGGAATG-AGAAGAGG-3′，產(chǎn)物 211 bp。以β-actin為內(nèi)參。先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后上ABI公司的7500型實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測。反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 10 μl，DyeⅡ 0.5 μl(10 μmol/L)，上、下游引物各1 μl(5 pmol/L)，cDNA 1.0 μl，ddH2O 6.5 μl。反應(yīng)條件：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。利用實(shí)時(shí)PCR儀自帶軟件獲得Ct值，△△Ct=△Ct樣本-△Ct對照=(Ct樣本-Ct內(nèi)參)-(Ct對照-Ct內(nèi)參)，表達(dá)量RQ=2-△△Ct。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、血清淀粉酶活性變化

造模36 h后，對照組、ANP組和生大黃組大鼠血清淀粉酶活性分別為(1431±369)、(5684±452)、(5721±554)U/L，ANP組和生大黃組顯著高于對照組(P值均<0.05)，而ANP組和生大黃組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、胰腺組織病理改變

對照組胰腺腺泡結(jié)構(gòu)完整，無炎細(xì)胞浸潤；ANP組胰腺組織大片壞死、出血，大量炎細(xì)胞浸潤；生大黃組胰腺腺泡結(jié)構(gòu)尚好，間質(zhì)水腫，較多炎細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主(圖1)。

圖1對照組(a)、ANP組(b)、生大黃組(c)大鼠胰腺病理改變(HE ×200)

三、胰腺組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)

ANP組大鼠胰腺IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)水平較對照組顯著增加；生大黃組胰腺IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)較ANP組顯著減少，但仍顯著高于對照組(P值均<0.05；圖2，表1)。

圖2各組胰腺組織IL-6(a)、IL-8(b)、TNF-α(c) mRNA表達(dá)

組別只數(shù)IL?6mRNAIL?8mRNATNF?αmRNA對照組110．29±0．130．35±0．151．09±0．32ANP組112．23±0．49a2．26±0．51a5．24±0．59a生大黃組110．97±0．30ab1．02±0．34ab2．59±0．36ab

注：與對照組比較,aP<0.05；與ANP組比較,bP<0.05

討 論

近年來大量的研究表明，急性胰腺炎(AP)除局部病變外，也是一種累及胰腺周圍組織和遠(yuǎn)隔器官、系統(tǒng)的急性炎癥過程。SAP損害的最初反應(yīng)是細(xì)胞分子網(wǎng)的反應(yīng)。體內(nèi)各種細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)一經(jīng)啟動(dòng)，即可發(fā)生全身性的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)AP的發(fā)展。促炎性細(xì)胞因子主要有IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1等，抑炎性細(xì)胞因子有IL-10、轉(zhuǎn)化性生長因子等，它們共同作用介導(dǎo)炎癥的發(fā)展[3]。IL-6是一種重要的急性反應(yīng)期炎癥介質(zhì)，能很好地反映AP的嚴(yán)重程度，可作為預(yù)測AP程度的重要指標(biāo)[4]。TNF-α由胰腺實(shí)質(zhì)中浸潤的白細(xì)胞產(chǎn)生，除刺激IL-6、IL-8產(chǎn)生外，還能刺激產(chǎn)生并播散幾乎所有嚴(yán)重?cái)⊙Y中的有害物質(zhì)。TNF-α的大量失控性釋放是導(dǎo)致SAP的重要因素[5]。TNF-α和IL-6、IL-8可以啟動(dòng)級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)其他細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而造成胰腺組織的水腫、出血和壞死，并且可以作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞引起微循環(huán)障礙、休克等 。

SAP病程早期具有中醫(yī)陽明腑實(shí)證的特點(diǎn)，臨床常采用通里攻下法為主進(jìn)行治療，其主要藥物就是大黃。大黃味苦性寒,攻積導(dǎo)滯、瀉火解毒，具有促進(jìn)大腸蠕動(dòng)、維護(hù)腸道屏障功能、防治腸菌易位、利膽、松弛Oddi括約肌、抑制胰酶分泌、改善微循環(huán)和防治微血栓形成等作用[6]。焦東海等[7]從大黃中獲得了對胰酶具有活性的10種單體。在三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的大鼠直腸炎模型中，采用地塞米松治療具有強(qiáng)效的抑炎效果，但也具有明顯的免疫抑制效應(yīng)。地塞米松聯(lián)合大黃多糖治療，不僅具有抗炎作用，而且可以調(diào)控大鼠機(jī)體的免疫反應(yīng)，可以誘導(dǎo)Th1淋巴細(xì)胞的增殖,促進(jìn)Th1/Th2細(xì)胞的平衡，顯著改善組織炎癥反應(yīng)[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP大鼠胰腺組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)較對照組顯著增加，提示機(jī)體處于促炎細(xì)胞因子占優(yōu)勢的狀態(tài)。而生大黃治療組大鼠胰腺組織IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)值顯著低于ANP組，顯示大黃可以抑制促炎因子的表達(dá)，同時(shí)胰腺組織壞死、充血、炎細(xì)胞浸潤也較ANP組顯著改善。因此，臨床上早期鼻飼或空腸灌注生大黃煎劑有可能阻止SAP病情的進(jìn)展，且生大黃價(jià)格低廉，使用簡單，值得臨床推廣應(yīng)用。

[1] 李杰,李賀,孫備,等.大黃聯(lián)合電針促進(jìn)重癥急性胰腺炎胃腸道功能復(fù)蘇的臨床研究.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009,29:661-662.

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2011-03-10)

(本文編輯：屠振興)

Inhibitionoftheexpressionofinflammationcytokinesbyrhubarbinexperimentalacutenecrotizingpancreatitisrats

JINJing,GAOJun,LüShun-li,LIUFeng,GONGYan-fang,MANXiao-hua,WUHong-yu,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email：zhsli@81890.net

ObjectiveTo observe the changes of inflammation cytokines in pancreas tissues of experimental acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats treated with rhubarb.MethodsThirty-three rats were randomly divided into sham operation group, ANP group and rhubarb treatment group with 11 rats in each group．ANP model was induced by retrograde injection of 3% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct, and jejunostomy was performed. Rats in rhubarb treatment group were fed with 1 g/ml rhubarb at the dose of 1 ml/kg body weight via jejunum route. Thirty-six hours later the rats were sacrificed. The serum level of amylase was measured; part of the pancreatic tissue was harvested for routine pathologic examination; total RNA was extracted from pancreatic tissue. The expression of IL-6, IL-8, and TNF-α mRNA was measured by real-time PCR.ResultsAfter ANP induction, the serum level of amylase was significantly increased, and pancreatic tissue necrosis, bleeding and inflammatory cell infiltration were observed, which was consistent with changes of ANP. The expressions of IL-6, IL-8, and TNF-α mRNA were 0.29±0.13, 0.35±0.15, 1.09±0.32 in sham operation group, while they were 2.23±0.49, 2.26±0.51,5.24±0.59 in ANP group, which were significantly higher than those in sham operation group (P<0.05). The corresponding values were 0.97±0.30, 1.02±0.34, 2.59±0.36 in rhubarb treatment group, which were significantly lower than those in ANP group, but they were still significantly higher than those in sham operation group (P<0.05).ConclusionsRhubarb lavage via jejunum route can decrease the expressions of IL-6, IL-8, and TNF-α, therefore attenuate the pancreatic pathologic injuries.

Pancreatitis, acute necrotizing; IL-6; IL-8; TNF-α; Rhubarb

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.014

國家自然科學(xué)基金(30772138)；上海市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(11441901800)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email：zhsli@81890.net