過氧化物酶體增殖物激活受體-γ在大鼠慢性胰腺炎進程中的表達及意義

黃玲 高峻 蔣斐 路箏 滿曉華 許愛芳 李兆申

·論著·

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ在大鼠慢性胰腺炎進程中的表達及意義

黃玲 高峻 蔣斐 路箏 滿曉華 許愛芳 李兆申

目的探討過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)在大鼠慢性胰腺炎(CP)進程中的表達及其意義。方法經大鼠尾靜脈一次性注射二丁基二氯基錫方法制備CP模型。按體重隨機分為對照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組。行胰腺常規病理檢查，Sirius Red染色觀察膠原含量，測定胰腺組織髓過氧化物酶(MPO)活性，免疫組化法測定α-SMA、PPAR-γ蛋白的表達。結果造模7 d內胰腺呈急性炎癥改變，42 d時出現不同程度的腺泡壞死、萎縮，淋巴細胞、單核細胞浸潤，小葉內或小葉周圍纖維化形成，伴胰管改變，符合從急性胰腺炎(AP)向CP的進展過程。造模后1 d，胰腺組織MPO活性、α-SMA蛋白表達即顯著增加[(0.78±0.71)U/g比(0.15±0.05)U/g，6.67±3.14比0，P值均<0.05]，之后隨造模時間延長未繼續增加。造模后7 d，膠原含量達峰值，為(45.42±15.99)%，較對照組的(10.87±2.28)%顯著增加(P<0.05),膠原沉積從僅在血管壁進展到沉積在導管周圍至小葉內和(或)小葉周圍。對照組PPAR-γ僅在血管壁呈陽性表達，表達量為0.17±0.41，隨造模時間延長表達漸增強，42 d達峰值，為4.83±2.71。結論在CP造模過程中PPAR-γ蛋白表達逐漸增強，并發揮有限的抗炎癥和抗纖維化作用。

胰腺炎，慢性； 過氧化物酶體增殖物激活受體-γ； 星形細胞

慢性胰腺炎(CP)是一種多因素共同參與的炎癥過程，其特征是胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells，PSCs)被激活，合成并釋放大量細胞外基質蛋白、炎癥介質和細胞因子，引起胰腺組織進行性纖維化，導致胰腺內外分泌功能受損。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)參與PSCs的活化和功能調節。本研究動態觀察大鼠從急性胰腺炎(AP)進展為CP過程中PPAR-γ的表達變化，探討其意義。

材料與方法

一、實驗動物及分組

42只清潔級雄性Wistar大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，6～8周齡，體重(200±20)g，動物合格證號：SCXK(滬)2007-0005。自由飼養1周后稱重，按體重隨機法分為對照組及造模后 1、3、5、7、14、42 d組。參考文獻[1,2]方法，采用尾靜脈一次性注射二丁基二氯基錫(di-n-butyltin dichloride，DBTC)8 mg·ml-1·kg-1體重的方法建立大鼠CP模型。對照組尾靜脈注射100%乙醇和甘油配制成的有機溶劑1 ml/kg體重。造模后1、3、5、7、14、42 d分批處死大鼠。取胰腺組織，部分置10%甲醛溶液固定，部分置-80℃保存。

二、方法

1．胰腺組織病理檢查及膠原纖維染色：取固定的胰腺組織，常規石蠟包埋、切片、HE染色，普通光鏡下觀察組織學變化，并參考Merkord等[3]方法從異常結構、腺泡萎縮、纖維化、炎癥細胞浸潤等4方面行組織病理評分；另取切片行Sirius Red染色，每張切片隨機觀察3個高倍視野，應用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統測定Sirius Red陽性染色面積(%)[4]。

2．胰腺組織髓過氧化物酶(MPO)活性測定：應用MPO試劑盒(南京建成生物工程研究所)檢測MPO活性，按說明書操作。MPO活性表示中性粒細胞的數目。

3．胰腺組織α-SMA、PPAR-γ蛋白表達的檢測：采用Envision免疫組化方法檢測?？功?SMA和PPAR-γ一抗1∶100稀釋。用PBS代替一抗作為陰性對照。以胞質或胞核出現棕黃染色顆粒為陽性染色。高倍鏡下隨機選取3個視野，計數陽性細胞百分比及染色強度。陽性細胞0、<10%、10%～50%、>50%分別計0～3分；染色程度為淺黃色、黃褐色、深褐色分別計1～3分。兩分乘積為免疫組化陽性指數(positive index, PI)[5]。

三、統計學處理

結 果

一、大鼠CP模型的建立

對照組大鼠胰腺大體和組織學未見改變(圖1上a)，血管壁膠原沉積(圖1上b)。造模后7 d內大鼠胰腺充血、水腫明顯，組織學呈AP病理改變，伴導管周圍出現膠原沉積。隨時間延長，胰腺組織血供減少，呈黃色、薄平狀，主胰管輕度至重度擴張。造模14 d后可見胰周滲出、粘連，部分大鼠可見膽管重度擴張、肝臟腫大、膽汁淤積等改變，膠原沉積在導管周圍至小葉內和(或)小葉周圍(圖下a)。42 d時出現不同程度的腺泡壞死、萎縮，淋巴細胞及單核細胞浸潤，小葉內或小葉周圍纖維化形成，伴胰管改變(圖下b)。各組胰腺病理學評分見表1，對照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組的膠原含量分別為(10.87±2.28)%、(13.72±6.96)%、(22.42±8.40)%、(33.51±20.84)%、(45.42±15.99)%、(37.46±18.91)%、(34.72±11.69)%。胰腺病理改變符合從AP進展到CP的過程，表明造模成功。

二、胰腺組織MPO活性變化

對照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組的胰腺組織MPO活性分別為(0.15±0.05)、(0.78±0.71)、(0.38±0.1)、(0.44±0.17)、(0.36±0.1)、(0.33±0.15)、(0.45±0.15)U/g。造模各組胰腺的MPO活性均顯著高于對照組(P值均<0.05)。

三、胰腺組織α-SMA蛋白表達的變化

對照組α-SMA僅在胰腺內血管壁表達(圖1上c)；造模后α-SMA最初位于血管壁、導管壁，漸累及小葉內和(或)小葉間區域(圖1下c)。對照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組α-SMA表達的PI分別為0、6.67±3.14、5.00±2.68、5.50±1.97、6.67±3.14、5.67±2.88、5.67±2.88。造模各組的α-SMA表達均顯著高于對照組(P值均<0.05)

四、胰腺組織PPAR-γ蛋白表達的變化

對照組PPAR-γ僅在胰腺內血管壁陽性表達(圖1上d)；造模后3 d，PPAR-γ在腺泡、導管和(或)胰島細胞陽性表達，隨時間延長表達漸增強，42 d表達最強(圖1下d)。對照組及造模后1、3、5、7、14、42 d組胰腺PPAR-γ表達的PI分別為0.17±0.41、0.17±0.41、2.17±1.60、2.33±1.37、3.00±2.00、3.17±1.83、4.83±2.71。造模3 d后，胰腺PPAR-γ表達顯著高于對照組(P值均<0.05)。

討 論

PPAR-γ屬核激素受體家族的成員，它通過與配體結合方式來激活轉錄因子，其內源性配體包括脂肪酸、花生四烯酸代謝產物和前列腺素，人工合成配體包括非類固醇抗炎藥物以及抗糖尿病藥物噻唑烷二酮類家族的成員，如曲格列酮等。研究發現，在大鼠失血性休克模型，內源性配體釋放激活的PPAR-γ，可避免失血性休克所致的肝臟損傷[6]。Nakajima等[7]在小鼠腸道缺血-再灌注損傷模型中發現，腸道組織存在內源性PPAR-γ途徑，內源性配體激活PPAR-γ為腸道缺血-再灌注損傷提供保護作用，包括直接受累的組織和遠處臟器。同時，PPAR-γ配體在許多炎癥模型中發揮抗炎作用，如肺炎[8]、心肌再灌注損傷[9]、類風濕性關節炎[10]、膿毒癥[11]、帕金森病[12]、阿爾茨海默病[13]和動脈粥樣硬化癥[14]等。

圖1對照組(上)和CP組(下)胰腺病理改變(a)、膠原纖維沉積(b)及α-SMA(c)、PPAR-γ(d)表達(HE，SiriusRed染色，免疫組化 ×200)

表1 各組大鼠胰腺組織病理評分

注：與對照組比較，aP<0.05

目前，一些研究揭示了PPAR-γ與PSCs的關系。Masamune等[15]報道，PPAR-γ配體15 d-PGJ2或曲格列酮能夠抑制PSCs的激活，降低α-SMA、前膠原α和脯氨酰羥化酶mRNA的水平，具有抗纖維化和抗炎癥作用。Shimizu等[16]報道，PPAR-γ激動劑曲格列酮以劑量依賴性方式增加PSCs的吞噬活性和CD36的表達；阻斷CD36能夠減弱曲格列酮所誘導的吞噬作用；沉默PPAR-γ基因，吞噬作用和CD36的表達減弱。Mews等[17]報道，在大鼠AP形成過程中，胰腺組織TNF-α和IL-10等因子釋放增多，它們能夠激活PSCs；當AP反復發作，這些細胞因子使PSCs始終處于激活狀態，膠原合成漸增，最終導致胰腺纖維化形成。本研究顯示，造模后7 d內胰腺出現AP的組織學改變，α-SMA表達及膠原含量顯著增加，并達到峰值，反映了AP過程釋放的一些炎癥介質和細胞因子能夠激活PSCs，大量合成細胞外基質。胰腺組織MPO活性在造模后1 d達峰值，提示在急性炎癥反應中以中性粒細胞浸潤為主。此時PPAR-γ蛋白呈低水平表達。隨著炎癥持續存在，α-SMA表達及膠原含量沒有進一步的增加，而PPAR-γ表達逐漸增強，42 d時達峰值。提示在胰腺纖維化病變形成過程中，PPAR-γ可能抑制PSCs的激活，抑制炎癥反應，進而發揮有限的抗炎癥和抗纖維化作用。

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2011-05-08)

(本文編輯：呂芳萍)

ExpressionsofPPARγproteinduringthecourseofpancreaticfibrosisofchronicpancreatitisinWistarrats

HUANGLing,GAOJun,JIANGFei,LUZheng,MANXiao-hua,XUAi-fang,LIZhao-shen.

DigestiveDiseaseDiagnosisandTreatmentCenter,SongjiangHospital,FirstPeople′sHospitalofShanghai,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai201600,China

LIZhao-shen,Email:lizhaoshen111@gmail.com

ObjectiveTo observe the expressions of PPAR-γ protein during the course of pancreatic fibrosis of chronic pancreatitis(CP) in Wistar rats and its significance.MethodsBibutyltin dichloride (DBTC, 8 mg/kg body weight) in a volume of 200 ml solvent was injected into the tail vein to establish the CP rat's model. Wistar rats were randomly divided into control group and 1, 3, 5, 7, 14, 42 d group according to weights. Pancreatic tissue underwent routine pathological examination, and collagen accumulation in pancreatic sections was determined by staining for Sirius Red. Pancreatic myeloperoxidase (MPO) activity was determined. Expressions of α-SMA and PPAR-γ proteins were assessed by immunohistochemical method.ResultsLight microscopy showed signs of acute pancreatitis with interstitial edema and infiltration of neutrophilic granulocytes 7 d after DBTC injection. Acinar cells necrosis, atrophy, lymphocytes and monocytes infiltration, fibrosis within lobule and peri-lobule as well as pancreatic duct changes were found, which was in accord with the course from AP to CP. One days after induction, the activity of MPO, expressions of α-SMA was significantly increased[(0.78±0.71)vs(0.15±0.05)U/g, 6.67±3.14vs0,P<0.05], then it did not increase with time of induction. Seven days after induction, collagen level reached the peak [(45.42±15.99)%], which was significantly higher than that in control group [(10.87±2.28)%,P<0.05]. Collagen fibers accumulated from periductal to intra-acinar and/or inter-acinar areas. In control rats, the expression of PPAR-γ protein was positive only in vessel walls, and the expression level was 0.17±0.41 and increased with time of induction, then reached the peak of 4.83±2.71 at 42 d.ConclusionsDuring the course of pancreatic fibrosis in rats, the expression of PPAR-γ protein is gradually increased, and plays a limited anti-inflammation and anti-fibrosis role.

Pancreatitis, chronic; Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; Astrocytes

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.015

201600 上海，上海交通大學第一人民醫院松江分院消化疾病診治中心(黃玲)；第二軍醫大學長海醫院消化內科(高峻、蔣斐、路箏、滿曉華、許愛芳、李兆申)

李兆申，Email:lizhaoshen111@gmail.com