3-氨基苯硼酸紙片法檢測大腸埃希菌高產AmpC酶的探討*

李 靜 胡志東 田 彬 徐海茹 李 金

AmpC酶又稱誘導酶，屬于Bush分類中的Ⅰ類酶及分子生物學中的C類酶[1]。AmpC酶多數由染色體介導，部分呈誘導型表達。近年也陸續發現了質粒介導AmpC酶，其耐藥基因可在同種或不同種屬細菌間廣泛傳播，使細菌耐藥日趨復雜，給臨床治療提出了嚴峻的挑戰，迫切需要臨床實驗室能快速而準確地檢測產AmpC酶的細菌。目前臨床實驗室標準化委員會（CLSI）尚未確定檢測的標準方法，本研究以三維試驗和聚合酶鏈反應（PCR）為參照，與3-氨基苯硼酸（APB）雙紙片協同法進行比較，以評價APB雙紙片協同法用于臨床實驗室檢測臨床分離的大腸埃希菌的可靠性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2010年1月—10月天津醫科大學總醫院住院患者各類送檢標本（包括痰、尿、血、胸水、腹水等），經常規方法進行細菌分離，用Compact全自動微生物分析儀鑒定，選取無重復分離大腸埃希菌44株進行研究。大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、肺炎克雷伯菌ATCC 700603購自衛生部臨檢中心。陰溝腸桿菌O29M（染色體介導，AmpC酶持續高產株）、ACT-1質粒介導AmpC酶大腸埃希菌由北京協和醫院檢驗科惠贈。

1.2 主要試劑與儀器 頭孢西丁（FOX，30 μg）、頭孢他啶（CAZ，30 μg）、頭孢噻肟（CTX，30 μg）購自北京天壇藥物生物技術開發公司，水解酪蛋白（MH）瓊脂粉購自上海伊華醫學科技有限公司，APB干粉購自Sigma公司。DNA Marker、PCR擴增試劑購于北京全式金生物技術有限公司，VITEK-2 compact全自動微生物系統及鑒定卡、藥敏試驗卡購自法國生物梅里埃公司，9700型DNA擴增儀為美國Perkin Elmer公司產品，Gel Doc 2000凝膠成像系統儀為美國Bio-Rad公司產品，水平電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 APB紙片制備方法 以二甲基亞砜作為溶劑，配成60 g/L的APB溶液，取5 μL上述APB溶液分別加入到直徑為6 mm，吸水量為20 μL的無菌空白濾紙上，使每片測試紙片上含有APB 300 μg，待紙片干燥后，至2℃～8℃下保存備用。

1.3.2 APB雙紙片協同試驗 參照文獻[2]方法，將待測菌株配成0.5麥氏單位的菌液，均勻涂布MH平板，稍干后中央貼APB紙片，在距中央12 mm的位置貼上CAZ、CTX紙片，35℃過夜培養，以APB與任何一種頭孢菌素產生協同為陽性，見圖1。

1.3.3 三維試驗 參照文獻[3]進行，以陰溝腸桿菌O29M作為產AmpC酶的陽性對照,以肺炎克雷伯菌ATCC 700603為陰性對照。（1）粗提酶液制備（凍融裂解法）：將質控菌和待檢菌密涂于1/4MH瓊脂平板（平板直徑為90 mm）上，35℃孵箱培養24 h后，用滅菌棉棒取下全部菌苔于1 mL滅菌生理鹽水中（用1.5 mL離心管），置-70℃低溫冰箱反復凍融5次。然后，在4℃條件下，10 000 r/min離心15 min，抽取上清液即為粗提酶液。（2）三維試驗：將0.5麥氏單位大腸埃希菌ATCC 25922菌液均勻涂布于MH平板上，取FOX紙片（30 μg/片）置于平板中央，使用刀片在離紙片邊緣5 mm處放射狀由里向外切割一道狹縫，用微量加樣器取30 μL酶粗提液由里向外加入狹縫內，酶液切勿溢出狹縫，將MH平板放入35℃孵箱過夜。若狹縫與抑菌圈處出現擴大的長菌區，則視為三維試驗陽性，見圖1。

1.3.4 DNA模板的制備 采用煮沸法。將菌株接種在MH平板上孵育18～24 h后，選取數個菌落至1.5 mL離心管中，加入滅菌雙蒸水150 μL，煮沸10 min后立即放冰上冷卻，于4℃12 000 r/min離心10 min，取上清液作為PCR反應模板立即使用，或-20℃保存備用。

1.3.5 PCR檢測AmpC酶基因 參照文獻[4]委托上海Sangon公司合成6對AmpC酶基因引物，見表1。PCR反應體系（25 μL）：dNTP2 μL、引物各0.5 μL、模板0.5 μL、Taq酶0.25 μL、10×PCR緩沖液2.5 μL、去離子水18.75 μL。PCR條件：94 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 1 min，30個循環后72℃延伸7 min。反應結束后取5 μL PCR產物經含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結果，用凝膠成像系統照相保存。

表1 PCR引物序列

1.4 統計學處理 采用配對χ2檢驗進行各組率的比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

APB雙紙片協同試驗、三維試驗、PCR法檢測結果的陽性率分別為70.5%、56.8%和75.0%。APB雙紙片協同試驗與三維試驗的陽性符合率為88.0%，陰性符合率為52.6%，總符合率為72.7%，2種檢測方法結果差異無統計學意義，見表2。以PCR結果為金標準,APB雙紙片協同試驗的靈敏度為90.1%，特異度為90.1%，符合率為90.1%，2種檢測方法結果差異無統計學意義，見表2。

表2 APB雙紙片協同試驗與三維試驗及PCR法比較結果 （株）

3 討論

產AmpC酶的致病菌因對多種抗生素耐藥，給臨床抗感染治療造成了很大的困難，高效的檢測方法能協助臨床合理用藥。AmpC酶是革蘭陰性菌產生的臨床上最重要的β-內酰胺酶之一，能對第3代頭孢菌素、單環類、頭霉素類等β-內酰胺類抗生素耐藥，其比超廣譜β-內酰胺酶具有更寬的底物譜且對酶抑制劑不敏感，已受到廣泛的重視[5]。大腸埃希菌是臨床上最常見的革蘭陰性桿菌病原菌，可以由染色體突變或質粒介導持續高產AmpC酶。

目前，AmpC酶檢測尚無統一標準，臨床實驗室檢測AmpC酶存在很多困難。國內外已報道了多種檢測AmpC酶的方法，但至今仍未建立起一種篩選和發現AmpC酶的標準的表型檢測方法[6]。三維試驗是目前公認的質粒AmpC酶或持續高產AmpC酶的經典檢測方法，其不受抗生素的誘導作用，準確率較高，結果清晰、易判讀；但三維試驗操作非常繁瑣且費時，另外，酶的種類以及提取酶的量影響對頭孢西丁活性的水解，因而難在一般實驗室常規使用。分子生物學檢測技術雖然能獲得準確的檢測結果，但操作復雜、費時、成本高，也無法用于常規檢驗。國內學者沈定霞等[7]提出用APB紙片增強試驗檢測高產AmpC酶和質粒AmpC酶；日本學者Yagi等[2]提出應用APB雙紙片協同試驗和增效試驗檢測大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌高產AmpC酶菌株；本研究采用Yagi等[2]提出的APB雙紙片協同試驗檢測大腸埃希菌高產AmpC酶，主要利用APB是AmpC酶抑制劑的原理設計，頭孢他啶和頭孢噻肟在靠近APB一側對細菌的抑菌圈直徑有擴大來推測該細菌高產AmpC酶[8]。

本研究顯示，APB紙片法、三維試驗和PCR法分別對44株大腸埃希菌進行AmpC酶檢測陽性率分別為70.5%、56.8%、75.0%，高于馮福英等[9]報道的16.7%，這可能與不同地區用藥特點、用藥水平、所選菌株及菌株數量等有關。三維試驗檢測陽性的25株菌中22株APB法也陽性，2種方法的陽性符合率為88.0%，3株APB法為陰性，分析其原因可能為：（1）菌株產酶量少，APB法沒有破壞細菌菌體使其釋放β-內酰胺酶，因而無法檢測到。（2）產AmpC酶菌株作用底物為頭孢他啶和頭孢噻肟以外的底物，造成APB法漏檢；9株APB法檢測為陽性的菌株，而三維試驗檢測為陰性，可能因為APB法存在部分假陽性菌株。PCR法檢測陽性的33株菌中，其中30株APB法也陽性，APB法的靈敏度為90.1%，特異度為90.1%，3株APB法為陰性，可能因為菌株產酶量少而無法檢測到，但也不排除APB法漏檢的可能性；1株APB法檢測為陽性的菌株，而PCR法檢測為陰性，分析其原因可能為：（1）部分菌株為高產AmpC酶菌株，PCR法檢測不到。（2）有部分菌株雖然是質粒AmpC酶菌株，可能攜帶基因為本文所檢測的6對引物擴增范圍以外的基因，導致PCR檢測不到。（3）APB法可能產生部分假陽性菌株。另外，本試驗過程中使用含300 μg APB紙片協同法檢測細菌產生的AmpC酶，操作簡便、快捷、經濟、實驗結果明確且易于判定，可供參考使用。

致謝：本研究中APB紙片制備部分得到天津金斯坦生物科技有限公司的大力支持和幫助。

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