pH-stat控制流加培養紅發夫酵母產蝦青素

朱曉立，梁世中，鄧毛程，朱明軍

（1.廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

pH-stat控制流加培養紅發夫酵母產蝦青素

朱曉立1，梁世中2，鄧毛程1，朱明軍2

（1.廣東輕工職業技術學院食品與生物工程系，廣東 廣州 510300；2.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

通過酸堿流加培養、混合碳源-氨水流加培養、混合碳源-尿素流加培養等pH-stat控制流加培養紅發夫酵母產蝦青素。pH-stat控制流加培養與分批培養相比較，生物量及蝦青素產量都有不同程度地提高。從提高蝦青素產量和降低生產成本綜合考慮，混合碳源-氨水流加培養是最理想的方法，培養96 h蝦青素產量最高達到19.94 mg/L。

紅發夫酵母；蝦青素；pH-stat；流加培養

色素與食品的關系密不可分，色素賦予食品誘人的色澤，從而給消費者帶來良好的感官質量和強烈的購買欲。食用色素按來源可分為天然和人造色素兩大類。近年來發現人工化學合成色素有的存在致癌和致突變作用，故天然色素日益受到人們重視，而開發具有一定營養價值或藥理作用的功能性天然色素，是色素工業發展的重中之重。

蝦青素是一種廣泛存在于生物體的紅色素，盡管“蝦青素”一詞在日常生活中不常使用，但蝦青素存在于許多種人類食物之中。大多甲殼類動物如蝦、龍蝦、螃蟹等呈現的紅色均因蝦青素積累所致，一些魚肉如鮭魚的肉色也是蝦青素積累的結果。在實際生產中，蝦青素常用作魚蝦等水產養殖動物的飼料添加劑，以便彌補人類膳食中蝦青素的缺乏，同時改善水產養殖產品的質量[1-2]。動物實驗表明蝦青素有抑制腫瘤發生[3]、增強免疫功能、延緩衰老[4]等多方面的生物學功能，因此在功能食品、飼料、化妝品和醫藥等方面有著廣闊的應用前景[5]。

紅發夫酵母所產蝦青素是胞內色素，菌體的高密度生長使蝦青素產量增加，通過營養物的流加分批培養能夠達到高密度菌體培養的目的。在搖瓶培養基成分優化組合研究的基礎上[6]，對紅發夫酵母的5 L反應器進行了發酵規律的研究。

1 材料與方法

1.1 菌株

紅發夫酵母菌株Phaffia rhodozyma由華南理工大學生化工程研究所馴化保存。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基（g/L）

葡萄糖 20，酵母粉 3，蛋白胨 5，麥芽汁 3，瓊脂20，pH5。

1.2.2 液體種子培養基（g/L）

葡萄糖20，酵母粉3，蛋白胨5，麥芽汁3，pH 5。

1.2.3 發酵培養基（g/L）

混合碳源（糖蜜40%、淀粉塘60%）30，混合氮源（玉米漿 40%、硫酸銨 60%）7，MgSO4·7H2O 1.5，（NH4）3C6H5O72，Na2HPO42.0，pH 5。

1.3 主要儀器與設備

高效液相色譜儀：美國安捷倫公司（型號：DG－2）；紫外分光光度計：澳大利亞GBC科儀公司（型號：CINTRA20）；電子分析天平：瑞士制造（型號：AG204）；生化培養箱：澳大利亞Thermoline（型號：WEST6100）；低溫搖床：美國BRUNSWICK科學有限公司（型號：Innova4330）；超凈工作臺：蘇凈集團安泰公司；冷凍離心機：日本日立公司（型號：CF7D2）；pH計：美國Sartorius公司；電熱鼓風恒溫干燥箱：上海實驗儀器廠；立式電熱壓力蒸汽消毒器：浙江紹興醫療器械廠（型號：YXQ.L31.400）；手提式壓力蒸汽消毒器：江陰濱江醫療設備廠（型號：YX－280）；發酵罐：德國BBrau公司生產的5 L反應器；光學顯微鏡：無錫照相器材廠（型號：L－1000）；恒溫水浴鍋：深圳天南地北實業有限公司。

1.4 培養方法

1.4.1 菌種保藏

1）菌株接入斜面培養基，20℃培養48 h，4℃保藏，每月傳代1次；

2）20℃培養48 h，離心后加無菌新鮮培養基和甘油，甘油濃度10%～20%，-70℃～-80℃低溫冷凍保藏。

1.4.2 種子培養

將一環菌苔（20℃培養3 d～4 d的斜面種）接種于250mL的錐形瓶，20℃、150r/min的恒溫搖床培養48h。

1.4.3 搖瓶培養

250 mL錐形瓶中裝30 mL培養基，滅菌后以8%（體積分數）的接種量接入培養48 h的種子液，20℃、150 r/min搖床培養。

1.4.4 生物反應器培養

反應器和培養基滅菌后以8%（體積分數）的接種量接入培養48 h的種子液，控制通氣和攪拌，按照一定的方式補料，并定時取樣測定數據。培養過程中維持溫度為20℃，培養液pH為5.0。

1.5 測定方法

1.5.1 酵母生物量的測定

取10 mL培養液，3000 r/min離心10 min，倒掉上清液，用蒸餾水離心洗滌2次后再用蒸餾水將菌體移入預先干燥至恒重M0的稱量瓶中，置于105℃電熱恒溫干燥箱中干燥至恒重，用精密電子天平稱量稱量瓶和菌體總重M，則生物量可用下式計算：

1.5.2 培養液中殘糖的測定

采用菲林試劑快速滴定法測定總糖。

1.5.3 蝦青素的提取[7]

取5 mL培養液，離心分離洗滌3次，加3 mL 3 mol/L HCl，沸水浴3 min，迅速冷卻，離心分離洗滌2次，添加5 mL甲醇振蕩提取1 min，離心取上清液。如果提取不完全，再加甲醇提取，直至菌體無色。提取液置冰箱冷藏至測定。

1.5.4 蝦青素測定[8]

采用 HPLC 測定。流動相為 φ甲醇:φ乙腈=9:1，流動相流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃，PDA檢測器在474 nm處進行蝦青素分析。以Sigma公司的蝦青素作為標準樣。

2 結果與討論

2.1 分批培養

將經活化培養48 h的種子液按8%（體積分數）接種量接入含3.5 L培養基的5 L反應器中，培養溫度20℃，初期控制溶氧50%，后期由于耗氧增加，控制在40%。不補料也不控制pH，每12 h測定生物量、降糖曲線、pH變化曲線、蝦青素含量和蝦青素產量變化曲線。5 L反應器分批培養紅發夫酵母生長曲線如圖1所示。

圖1 5 L反應器分批培養紅發夫酵母生長曲線Fig.1 Growth curves of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

從圖1可知，0 h～12 h為延遲期，紅發夫酵母生物量增加不明顯，耗糖速率較慢；12 h～36 h為指數生長期，生物量增加明顯，耗糖速率很快，12h生物量1.61g/L，而36 h的生物量10.46 g/L；36 h～84 h為減速期，生物量增加和耗糖速率減慢，60 h生物量16.91 g/L，殘糖僅剩2.5 g/L；84 h～120 h為靜止期，生物量和殘糖變化不大，84 h生物量最高17.68 g/L，120 h生物量17.61 g/L。5 L反應器分批培養紅發夫酵母蝦青素變化曲線如圖2所示。

圖2 5 L反應器分批培養紅發夫酵母蝦青素變化曲線Fig.2 Astaxanthin curves of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

從圖2可知，在指數生長期內，蝦青素合成速率較快。12 h蝦青素含量僅為50 μg/g；此后平滑上升，36 h蝦青素含量283 μg/g；36 h～48 h，蝦青素大量合成，蝦青素含量和產量突增，48 h蝦青素含量591 μg/g，產量8.28 mg/L。此后，蝦青素合成速率減慢，108 h蝦青素含量最高768 μg/g，蝦青素產量也最高13.54 mg/L。5 L反應器分批培養pH變化曲線如圖3所示。

從圖3可知，分批培養pH的變化過程。0 h～24 h pH 下降，24 h pH4.44；24 h～36 h 上升，36 h pH6.74；48 h pH下降后，逐漸回升至6.50左右，并基本維持在這個水平。這說明在培養初期隨著糖分的消耗，產生較多的酸性物質，導致pH值下降，糖分消耗完后，堿性物質增多，pH再度上升。

圖3 5 L反應器分批培養pH值變化曲線Fig.3 pH curve of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

2.2 pH-stat控制流加培養

pH-stat控制流加培養是補料分批培養的一種，即通過流加控制pH基本恒定在最佳值。補料分批培養是一種介于分批培養和連續培養之間的操作方式，在進行分批培養的時候，向反應器加入培養基的一種或多種成分，以達到延長生產期和控制培養過程的目的。

2.2.1 酸堿流加培養

將經活化培養48 h的種子液按8%（體積分數）接種量接入含3.5 L培養基的5 L反應器中，培養溫度20℃，初期控制溶氧50%，后期由于耗氧增加，控制在40%。pH用濃氨水和10%的硫酸控制在5.0左右，每12 h測定生物量、降糖曲線、pH變化曲線、蝦青素含量和蝦青素產量變化曲線。5 L反應器pH-stat流加培養紅發夫酵母生長曲線如圖4所示。

圖4 5 L反應器pH-stat流加培養紅發夫酵母生長曲線Fig.4 Growth curves of pH-stat fed-batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

從圖4可知，酸堿流加培養很好的控制pH在5.00左右，因此酵母細胞生長比沒有控制pH值的分批培養要好。12 h細胞生物量4.68 g/L；24 h～48 h為指數生長期，耗糖速率較快；48 h生物量16.97 g/L，高于同期分批培養生物量，提高了21.13%；此后減速，84 h到108 h為靜止期，84 h生物量最高18.65 g/L，相對于分批培養生物量最高值提高了5.5%。5 L反應器pH-stat流加培養紅發夫酵母蝦青素變化曲線如圖5所示。

圖5 5 L反應器pH-stat流加培養紅發夫酵母蝦青素變化曲線Fig.5 Astaxanthin curves of pH-stat fed-batch of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

從圖5可知，在指數生長期內，蝦青素合成速率較快，相對于分批培養上升比較平穩。12 h蝦青素含量僅為140 μg/g；此后逐漸上升，36 h蝦青素含量285 μg/g；36 h～48 h，蝦青素大量合成，蝦青素含量和產量突增，48 h蝦青素含量535 μg/g，產量9.05 mg/L；此后，蝦青素積累繼續增加，96 h蝦青素含量最高851 μg/g，蝦青素產量也最高15.82 mg/L，相對于分批培養要早12 h，也提高了10.8%和16.8%。

2.2.2 混合碳源-氨水流加培養

將經活化培養48 h的種子液按8%（體積分數）接種量接入含3.5 L培養基的5 L反應器中，培養溫度20℃，初期控制溶氧50%，后期由于耗氧增加，控制在40%。以混合碳源（糖蜜和淀粉糖）代替硫酸，用氨水代替氫氧化鈉來響應發酵pH變化的一種偶聯補料培養模式，10%氨水控制pH在5.00，當pH超過5.00時，由反應器系統自動泵啟動流加碳源，從而達到流加碳源和氮源的目的。每12 h測定生物量、降糖曲線、pH變化曲線、蝦青素含量和蝦青素產量變化曲線。5 L反應器pH-stat混合碳源流加培養紅發夫酵母生長曲線如圖6所示。

從圖6可知，由于24 h到36 h，培養液pH值上升很快，超過5.00，反應器系統自動流加混合碳源，殘糖從24 h14.8 g/L增加到36 h的22.1 g/L，此后基本控制pH在5.00左右，12 h細胞生物量2.9 g/L，由于流加了混合碳源，延長了細胞生長期；從24 h～96 h生物量一直在顯著增長，96 h生物量27.51 g/L，高于同期酸堿流加培養生物量，提高了47.8%；此后減速，96 h到120 h為平穩期，120 h生物量最高28.12 g/L，相對于酸堿流加培養生物量最高值提高了50.7%。5 L反應器pH-stat混合碳源流加培養紅發夫酵母蝦青素變化曲線如圖7所示。

圖6 5 L反應器pH-stat混合碳源流加培養紅發夫酵母生長曲線Fig.6 Growth curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by pH-stat feeding with mixture carbon sources

圖7 5 L反應器pH-stat混合碳源流加培養紅發夫酵母蝦青素變化曲線Fig.7 Astaxanthin curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by pH-stat feeding with mixture carbon sources

從圖7可知，在指數生長期中前期，蝦青素合成速率較快，相對于酸堿流加培養上升更明顯。12 h蝦青素含量僅為162 μg/g，此后蝦青素大量合成，蝦青素含量和產量突增，36 h蝦青素含量531 μg/g，到72 h蝦青素含量最高802 μg/g，相對于酸堿流加培養蝦青素含量最高值下降了，這是由于生物量大大增加引起的。96 h蝦青素產量達到最高19.94 mg/L，相對于酸堿流加培養蝦青素產量最高值提高了26%。

2.2.3 混合碳源-尿素流加培養

將經活化培養48 h的種子液按8%（體積分數）接種量接入含3.5 L培養基的5 L反應器中，培養溫度20℃，初期控制溶氧50%，后期由于耗氧增加，控制在40%。以混合碳源（糖蜜和淀粉糖）代替硫酸，以尿素代替氨水來響應發酵pH變化的一種偶聯補料培養模式，其中尿素和硫酸銨以4:1混合，相當于10 g/L的硫酸銨，當pH超過5.00時，由反應器系統自動泵啟動流加碳源，從而達到流加碳源和氮源的目的。每8小時測定生物量、降糖曲線、蝦青素含量和蝦青素產量變化曲線。5 L反應器流加混合碳源-尿素培養紅發夫酵母生長曲線如圖8所示。

圖8 5 L反應器流加混合碳源-尿素培養紅發夫酵母生長曲線Fig.8 Growth curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by feeding carbamide and mixture carbon sources

由圖8可知，在對數生長期細胞生長較快，比生長速率為3.70×10-2h-1。在64 h開始流加尿素后，細胞生長減緩。培養到144 h，生物量達到30.81 g/L。由圖8還可以看到，繼續培養生物量開始下降，說明細胞開始老化死亡。

本次試驗共流加約298 g糖分；初始培養液體積為3.5 L，糖濃度為35.22 g/L，含糖量為123.3 g；最終培養液體積4.5 L，殘糖濃度9.52 g/L，含糖量為42.8 g，故整個培養過程中實際耗糖量為378.5 g；生物量最終達到30.20 g/L，共計135.9 g，故糖分轉化為酵母細胞的轉化率為0.359。5 L反應器流加混合碳源-尿素培養紅發夫酵母蝦青素變化曲線如圖9所示。

圖9 5 L反應器流加混合碳源-尿素培養紅發夫酵母蝦青素變化曲線Fig.9 Astaxanthin curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by feeding carbamide and mixture carbon sources

由圖9可知，在136 h前，蝦青素產量呈持續增長狀態，并于136 h達到最大產量28 mg/L。136 h以后繼續培養，發現蝦青素產量和含量同步迅速下降，估計是酵母細胞進入衰亡期的原因。蝦青素含量在對數期增長較快，在加入尿素后，蝦青素含量穩步增大，并于136 h 達到最大值 923 μg/g。

3 結論

pH-stat控制流加培養相對于不控制pH-stat的分批培養，紅發夫酵母的生物量、蝦青素含量和產量都有顯著提高。但是，不同方式進行pH-stat控制流加培養的結果也有差異，以混合碳源（糖蜜和淀粉糖）代替硫酸，用氨水代替氫氧化鈉來響應發酵pH變化的偶聯補料培養模式，不僅能維持最適pH值，同時也流加了混合碳源，延長了細胞生長期，但各項指標最高值出現的時間并沒有推遲，相對于酸堿流加培養生物量最高值提高了50.7%，蝦青素產量最高值提高了26%。以混合碳源（糖蜜和淀粉糖）代替硫酸，以尿素代替氨水來響應發酵pH變化的偶聯補料培養模式，能同時達到流加碳源和氮源的目的，生物量、蝦青素產量及含量均達到了較高水平，但是流加尿素蝦青素合成積累較慢，培養時間過長，影響其實際生產操作的可行性。因此，以混合碳源代替硫酸，用氨水代替氫氧化鈉來響應發酵pH變化的偶聯補料培養模式是比較理想的方式。

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Study on Astaxanthin Production of Phaffia rhodozyma in pH-stat Fed-batch Cultures

ZHU Xiao-li1,LIANG Shi-zhong2,DENG Mao-cheng1,ZHU Ming-jun2
（1.Department of Food and Biology Engineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong，China；2 College of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China）

The growth and astaxanthin production of Phaffia rhodozyma in pH-stat fed-batch cultures with different feeding methods and grown at specific growth rates similar to the batch culture was compared.The results described that fed-batch culture was better than the batch culture.The different feeding methods included acid-alkali,compound carbon sources and ammonia,compound carbon sources and urea fed-batch culture.To the end of achieving and the cost efficiency of astaxanthin production,compound carbon sources and ammonia fed-batch culture was the best method,the highest astaxanthin production was 19.94 mg/L at 96 h culture time.

Phaffia rhodozyma;astaxanthin;pH-stat;fed-batch culture

廣東省科技攻關項目（2002C1040101）；廣州市科技計劃項目（2003Z2-E0131）

朱曉立（1980—），男（漢），工程師，講師，碩士，研究方向：食品生物技術。

2010-08-27