β-防御素及其與呼吸道疾病關系研究*

趙文娟 陳文慧 姚 政 陳 滟

云南中醫學院基礎醫學院,云南省昆明市 650500

防御素是一類廣泛存在于皮膚和黏膜上皮組織中具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽。近年來發現防御素不僅通過直接殺菌作用抵御入侵機體的病原微生物,還在介導獲得性免疫反應、調節機體的免疫炎癥反應和創傷修復過程中起著重要作用,是機體免疫系統的重要組成部分。因此,對于它的研究目前越來越受到人們的廣泛關注。

1 β-防御素的發現

防御素是抗菌肽家族中最大的亞家族,是一類重要的內源性抗菌肽。已從脊椎動物體內分離出許多防御素,根據其空間結構不同可分為3大類:α-防御素 、β-防御素 、θ-防御素 。 其中,β-防御素是 1991年Diamond等[1]首次在牛的氣管黏膜上皮細胞中發現的短肽,命名為 TAP(tracheal antimicrobial peptide),后來又在牛的粒性白細胞中發現了13種與TAP的序列高度同源的短肽,但其consensus序列與α-防御素不同,故被命名為β-防御素。人的β-防御素(Human β-defensin,HBD)目前已發現有 6種(HBD1～6)。人的第1種β-防御素(HBD-1)最初是在血液中發現,人的第 2種β-防御素(HBD-2)是由角蛋白產生,從牛皮癬患者的皮膚中發現的,隨后又發現在腎、尿液、宮頸黏液、下頜唾液腺、胰腺、氣管、前列腺、胎盤、睪丸、胸腺及小腸細胞中都有HBD-2的表達。2000年 Harder等[2]從銀屑病患者的皮損組織中發現了人的第3種β-防御素(HBD-3),并采用金黃色葡萄球菌親和柱進行了分離純化,從蛋白水平上發現了HBD-3。通過局部比對搜索工具(BLAST),發現了另外3種β-防御素(HBD4～6)。

2 β-防御素的分子結構

成熟的β-防御素包含36～50個氨基酸殘基,包括6個半胱氨酸殘基(Cysl-5,2-4,3-6)以獨特的空間模式形成二硫鍵,與 α-防御素相區別。Cys2-Cys4橋在多肽核內引入環狀共價鏈。β-防御素分子內含3個反向平行的β-折疊鏈,由3個分子內二硫鍵連接。β-片層與一個可變長度的α-螺旋片段連接,形成分子N末端片段。α-螺旋和β-片層的連接位點是通過二硫鍵來穩定的(Cysl-Cys5)。β-防御素有形成多種低聚結構的潛能 ,這些低聚結構影響著防御素蛋白的生物學活性和功能[3]。

3 β-防御素的生物學活性

3.1 抗菌活性 β-防御素抗菌譜較廣,是機體抵御外界微生物侵襲的第一道化學屏障。在機體固有免疫防御中發揮重要作用。β-防御素能廣泛殺滅G+菌和G-菌,體外試驗表明,β-防御素能夠抑制大腸桿菌、銅綠假單胞桿菌、金黃色葡萄球菌、白假絲酵母等,除了對肺炎克雷伯氏菌沒有明顯的抑制效果外,對以上幾種病原菌和熱帶白假絲酵母有抑菌作用,兩者的最低作用濃度(MIC)為6～50mg/ml[4]。一般認為β-防御素的直接殺菌機制是由于該分子帶正電,能與帶負電荷、呈陰性的細菌表面結合,結合后其分子中的疏水區可插入到細菌胞膜,而帶電區(帶正電荷)則與細胞膜上帶負電荷的磷脂頭部以及水分子相互作用。在細胞膜上多個β-防御素分子聚集形成孔隙或道。使正常情況下處于胞外的離子、多肽等流入胞內,而胞內重要的鹽類、大分子等泄漏到胞外,造成物質泄漏,最終導致不可逆性的菌體死亡[5]。

3.2 抗其他病原生物的活性 β-防御素能殺滅一些被膜病毒,如人類免疫缺陷病毒、皰疹病毒、水泡型口炎病毒、流感病毒等,但對無衣殼病毒卻無效。β-防御素對病毒的殺滅作用依賴于其分子內二硫鍵的緊密程度、防御素的濃度等因素,還與pH值、溫度等因素有關,在中性及低離子強度條件下,防御素具有較強的抗病毒活性[6]。此外,β-防御素對某些真菌、梅毒螺旋體和鉤端螺旋體、分枝桿菌等均有很強的抗菌活性,β-防御素還能有效地殺死引起人類及動物寄生蟲病的病原體,如瘧疾、chagas氏病、利什曼病的病原體。1998年,Shahabuddin研究發現防御素對瘧原蟲感染蚊子的不同時期有不同的作用。瘧原蟲的卵囊期和子孢子期較其他時期對防御素敏感,而且防御素對瘧原蟲卵囊期的損傷有時間依賴性,一般感染3d后,卵囊密度明顯降低[7]。

3.3 抗腫瘤細胞的活性 在體外試驗研究純化的β-防御素對人及小鼠數種腫瘤細胞的作用情況,發現β-防御素對白血病細胞系、淋巴瘤細胞系及實體瘤細胞具有毒性作用,并且這種抗腫瘤功效與其作用時間和劑量呈正相關。對人淋巴細胞及實體瘤細胞的細胞毒性作用更為顯著,尤其對抗 TNF的U9TR細胞、小鼠淋巴瘤YAC-1細胞和人組織細胞淋巴瘤U937細胞具有殺傷性[8,9]。

3.4 免疫活性 β-防御素不僅可以直接抵抗病原微生物,而且還具有免疫活性作用。HBD-2是肥大細胞的趨化因子,可引起肥大細胞活化和脫顆粒,致組胺和前列腺素釋放,進一步使中性粒細胞在炎癥部位移動和聚集[10]。這種趨化作用通過肥大細胞的高親和力受體完成。同時,HBD-2不僅對幼稚樹突狀細胞有趨化作用,還對記憶型T細胞有趨化性。近來Yang等報道,小鼠β-防御素-2能刺激小鼠幼稚樹突狀細胞轉化為成熟樹突狀細胞。β-防御素通過與趨化因子-6(CCR6)結合,趨化誘導幼稚樹突狀細胞和記憶T細胞聚集到炎癥部位,介導共刺激分子(如B7家族成員)的表達上調和幼稚樹突狀細胞的成熟,進而活化 T淋巴細胞,觸發體內強有力的特異性免疫應答[11]。此外,防御素還可以直接促進感染部位中性粒細胞的補充和積聚,也有研究表明β-防御素能夠激活人的補體系統[12]。

4 β-防御素與呼吸道疾病的相關研究

4.1 β-防御素與上呼吸道疾病 目前已發現β-防御素廣泛存在于鼻黏膜組織中,其功能的失活與病原微生物定植、集落于黏膜上皮而導致嚴重的感染關系密切,也可能參與鼻黏膜正常防御功能。β-防御素基因和蛋白質表達水平的上調與機體鼻黏膜系統發揮抗感染作用密切相關。Lee等[13]發現HBD-2 mRNA只在慢性鼻竇炎患者的下鼻甲黏膜和鼻息肉中檢測到,且在鼻息肉中的水平明顯高于鼻甲黏膜,這與參與鼻息肉形成的多種細胞因子,包括白細胞介素-3、白細胞介素-5、嗜酸性粒細胞誘導了HBD-2表達有關。β-防御素與咽喉部疾病的關系主要體現在慢性扁桃體炎中。腭扁桃體是咽黏膜相關淋巴組織的重要組成部分。王成碩等[14]應用逆轉錄聚合酶鏈反應的方法檢測了慢性扁桃體炎組和正常對照組的扁桃體組織中HBD-1和HBD-2 mRNA的表達,實驗結果表明:HBD-1在正常扁桃體和慢性扁桃體炎組織中均有表達,而HBD-2在單純增生的扁桃體組織僅微弱表達,但在慢性扁桃體炎組織中表達明顯升高。這表明HBD-1在扁桃體組織中為固有性表達,而HBD-2則為誘導性表達。以上結果與HBD在其他組織中的表達特點一致,說明扁桃體作為機體的“門衛”,是通過天然免疫和獲得性免疫兩種系統相互協調、相互補充來共同發揮作用的。此外,扁桃體上皮能夠表達HBD這一事實,也提示耳鼻咽喉科醫師應充分認識到扁桃體的天然免疫功能而慎行扁桃體切除手術。

4.2 β-防御素與下呼吸道疾病 肺囊性纖維化患者氣道有各種菌(常見綠膿桿菌和金葡菌等)定植和慢性感染過程,但這種感染只局限于呼吸道,而不造成全身擴散,說明是呼吸道局部防御功能缺陷所致。肺囊性纖維化是常染色體隱形遺傳性疾病,是由囊性纖維化跨膜轉導調節因子(CFT R)失去功能所致,CFTR是cAMP調節的氯通道。肺囊性纖維化的特點是氣道中性粒細胞炎性反應,慢性細菌感染和氣道阻塞。氣道過度炎性反應是CFT R喪失功能所致還是繼發于感染,在肺囊性纖維化患者的支氣管肺泡灌(BALF)中能檢測到HBD-1和HBD-2,HBD-2隨著肺功能的惡化而下降。說明防御素活性的改變可能是CF患者容易感染的原因之一[15]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)與HBD-1的基因多態性的發生有關。吸煙者只有10%～20%會發生COPD,因此除了環境因素外,遺傳因素參與COPD的發生。研究發現中國漢族人群中編碼HBD-1的基因HDEFBl 668C/G多態性與COPD易感性有關,HBD-3表達于支氣管和細支氣管上皮細胞,細菌性肺炎患者急性期血漿HBD-3濃度升高,治療結束后明顯降低。說明HBD-2參與氣道的抗微生物過程,并且可作氣道炎癥反應的有用標志物[16]。

5 展望

防御素不僅是新型高效的抗菌物質,而且作為機體本身的一種活性物質,相對不具有免疫原性,病原菌也不易對其產生耐藥性,因此可以替代抗生素發揮廣譜高效的抗菌作用。此外防御素能調節機體免疫應答和炎癥反應,調節組織創傷修復。因此,可以誘導β-防御素的表達,來增強機體抗感染能力和免疫力。目前已有的誘導劑由于其毒性作用,難以直接作用于人體和用于今后的臨床開發,是否存在安全有效的誘導劑便成為研究關注的焦點。

數千年來中藥在防治疾病方面發揮了重要的作用,研究表明大多數具有良好抑菌作用的中藥是通過全面提高機體免疫功能、增強機體抵抗力而達到抗菌目的。防御素的多種生物學活性給人們一個重要啟示:中藥有可能是通過誘導先天性免疫分子防御素的分泌發揮抗菌作用而啟動機體有效的抗感染。如果中藥確實能夠增加內源性防御素的表達,那么在天然防御素獲得困難的情況下,毫無疑問這一點對防御素開發成為抗生素也提供了新的思路。目前筆者研究團隊開展了關于玉屏風散影響上呼吸道黏膜β-防御素mRNA表達情況的研究,進而探索玉屏風散對上呼吸道黏膜非特異性免疫分子的作用機制,促進中藥誘導劑有效的研究及為中藥的新藥開發研究打下基礎,并期望將祖國傳統醫藥作為解決臨床耐藥菌的新治療途徑。

[1] Diamond G,Zasloff M,Eck H,et al.T racheal antimicrobial peptide,a cysteine-rich peptide from mammalian tracheal mucosa:Peptide isolation and cloning of a cDNA〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(9):3952-3956.

[2] Harder J,Bartels J,Christophers E,et al.Isolation and characterization of hmnan beta-defensin-3,a novel human inducible peptide antibiotic〔J〕.J Biol Chem,2001,276(8):5707-5713.

[3] Selsted ME,Harwig SS,Ganz T,et al.P rimary structures of three human nentrophil defensins〔J〕.J Clin Invest,1985,76(4):1436-1437.

[4] Xu QX,Zhao CY.Research and application of mammalian defensins〔J〕 .Fecd Pev,2007,(1):31-33.

[5] Valore EV,Park CH,Quay le AJ,et al.Human beta-defensin-1:an antimicrobial Peptide of urogenital tissues〔J〕.J Clin Invest,1998,101(8):1633-1642.

[6] 趙風立,朱連勤,喬彥良.β-防御素的研究進展〔J〕.飼料工業,2007,28(10):6-8.

[7] 林鎮湖,李德發.抗菌肽及其在醫學中的應用〔J〕.國際檢驗醫學雜志,2009,30(10):986-987.

[8] 余興邦,郭鎖鏈,烏翠蘭,等.防御素研究進展〔J〕.動物醫學進展,2006,27(8):47-51.

[9] Kluver E,Schulz-Maronde S.Structrure-activity relation of human beta-defensin 3:influence of disulfide bonds and cysteine substitution on antimicrobial activity and cytotoxicity〔J〕.Biochemistry,2005,44(28):9804-9816.

[10] Befus AD,Mowat C,Gilchris M,et al.Neutrophil defensins induce histamine secretion from mast cell:mechanisms of action〔J〕.J Immunol,1999,163(2):947-953.

[11] 周聯,俞瑜.防御素與先天性免疫及獲得性免疫〔J〕.國外醫學免疫學分冊,2005,28(2):68-72.

[12] Yang D,Chertov O,Bykovskaiasn SN,et al.Beta-defensins:linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6〔J〕.Science,1999,286(5439):525-528.

[13] Lee SH,Kim JE,Lin HH,et al.Antimicrobial defensin peptides of the human nasal mucosa〔J〕.Ann Otol Rhinol Laryngol,2002,111(2):135-141.

[14] 王成碩,董震,楊占泉,等.腭扁桃體中β-防御素的表達及意義〔J〕.臨床耳鼻喉科雜志,2005,19(7):129-131.

[15] Bals R,Weiner DJ,M eegalla RL,et al.Salt-independent abnormality of antimicrobial activity in cystic fibrosis airway surface fluid〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol,2001,25:21-25.

[16] 桂平,武慶平,姚尚龍.防御素與肺炎癥性疾病〔J〕.國際麻醉學與復蘇雜志,2007,28(6):556-560.