硒對(duì)慢性氟中毒致雄性大鼠生殖毒性的拮抗作用＊

尉俊仁， 馮 佩， 章子貴

(浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004)

氟是一種泛毒性物質(zhì)，不僅損害牙齒和骨骼等靶器官，而且對(duì)內(nèi)分泌、神經(jīng)、泌尿、生殖等非骨相系統(tǒng)也具有廣泛的毒性作用［1-2］．一些研究表明，氟致非骨相損害的機(jī)理之一是氟可引發(fā)體內(nèi)自由基生成而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)［3］．硒是人體必需的一種微量元素，具有較強(qiáng)的抗氧化作用．硒對(duì)氟中毒的影響尤為廣大研究者關(guān)注［4-5］，有關(guān)硒拮抗氟的報(bào)道均證實(shí)硒對(duì)氟致骨相、非骨相損傷均有保護(hù)作用，但在生殖毒理方面的研究仍然較少［6-12］．

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)雄性大鼠的氟硒聯(lián)合染毒，在前人相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，探明了氟硒染毒下雄性大鼠生殖系統(tǒng)的變化趨勢(shì)，揭示了硒對(duì)氟致雄性生殖系統(tǒng)損害的拮抗機(jī)理，評(píng)價(jià)了聯(lián)合染毒對(duì)不同酶的效果，以此探索生殖毒性的分子靶點(diǎn)，為地方性氟中毒，特別是氟致男性生殖系統(tǒng)損害的預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與染毒方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用初斷乳SD品系雄性大鼠240只，體質(zhì)量為70～90 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按每組30只隨機(jī)分成8組(見表1)．氟、硒質(zhì)量濃度的確定依據(jù)均建立在本實(shí)驗(yàn)室以往研究的基礎(chǔ)上［13-14］，并按照毒理學(xué)組間劑量組距的要求，以1∶2∶4設(shè)置．飼養(yǎng)室采用空調(diào)和自動(dòng)排風(fēng)裝置保持通風(fēng)，溫度控制在25℃左右，濕度保持于50% ～70%;以刨花為墊料，每2 d更換1次．染毒6月后稱體質(zhì)量，用斷頭法處死動(dòng)物，檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)．

1．2 各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)方法

用電子天平(精確到1 mg)測(cè)定大鼠睪丸和附睪的濕質(zhì)量．睪丸和附睪在稱量前注意去凈結(jié)締組織，洗凈其表面的血污，用濾紙吸干表面的水分．計(jì)算出臟器系數(shù)．

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況

制備睪丸、附睪組織勻漿，測(cè)定大鼠睪丸中乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)的活性，以及附睪中三磷酸腺苷酶(ATPase)的活性．試劑盒由南京建成生物工程研究所提供．

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS軟件完成．

2 結(jié)果

2．1 大鼠的一般癥狀

實(shí)驗(yàn)期間，各組大鼠未見明顯的異常和死亡，僅染硒組大鼠出現(xiàn)飲水量減少的現(xiàn)象，在國外相關(guān)報(bào)道［15］中也提到了類似現(xiàn)象，除此之外各組之間未見有顯著性差異．由表2可見:除了氟加低、中硒組大鼠的體質(zhì)量與對(duì)照組產(chǎn)生顯著性差異之外(P＜0．05)，其余各組大鼠的體質(zhì)量均無顯著性差異(P＞0．05);各組大鼠睪丸和附睪的臟器系數(shù)，雖然低硒組和高硒組有偏高的趨勢(shì)，氟加低硒組略有降低，但在總體上均無顯著性差異(P＞0．05)．

2．2 氟硒對(duì)睪丸中LDH，ACP，AKP活性的影響

由表3可見:染氟組大鼠睪丸組織中LDH活性與對(duì)照組比較有明顯的下降(P＜0．05)，其他組與對(duì)照組無明顯的差異(P＞0．05);中、高硒組與氟加高硒組與染氟組比較有顯著差異(P＜0．05)．同時(shí)，從表3還可看出，氟加硒組，特別是氟加高硒組比染氟組大鼠睪丸中LDH活性明顯升高．

染氟組和氟加中硒組大鼠睪丸組織中AKP活性與對(duì)照組比較有明顯的差異(P＜0．05)，其他組與對(duì)照組無明顯差異(P＞0．05);氟加低、高硒組大鼠睪丸中AKP活性有一定程度的升高，而氟加中硒組卻有明顯的升高，甚至超過了對(duì)照組．染氟組大鼠睪丸組織ACP活性與對(duì)照組比較有明顯的下降(P＜0．05)，其他組與對(duì)照組無明顯的差異(P ＞0．05)．

表3 各組大鼠睪丸組織中LDH，AKP，ACP活性的測(cè)定(x ± s，n=6)

表4 各組大鼠附睪中ATPase活性的測(cè)定(x ± s，n=6)

2．3 氟硒對(duì)附睪中ATPase活性的影響

由表4可見:大鼠附睪中Na+，K+-ATPase活性是高硒組及氟加高硒組較對(duì)照組明顯降低，存在顯著性差異(P＜0．05)，其他組有一定程度的降低，但與對(duì)照組沒有顯著性差異，氟加中硒組更是與對(duì)照組相近．大鼠附睪中Mg2+-ATPase活性是染氟組與對(duì)照組比較有所降低，但差異尚不顯著(P＞0．05)，其影響低于染硒組和氟加高氟組．Ca2+-ATPase活性是中硒組和氟加高硒組明顯高于對(duì)照組(P＜0．05)，其余各組尚未見差異(P＞0．05)．

3 討論

有關(guān)氟與生殖系統(tǒng)之間的關(guān)系越來越被眾多學(xué)者關(guān)注．有研究［16］表明，當(dāng)機(jī)體攝入過量的氟時(shí)，不僅會(huì)引起氟中毒，還有致突變及誘發(fā)染色體畸變的作用，對(duì)大鼠、小鼠等動(dòng)物的生殖功能也產(chǎn)生明顯的影響．

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，飲用含50 mg/L氟化鈉6月后的大鼠，體質(zhì)量略有下降，伴有氟斑牙、氟骨癥等病變，以及 LDH，AKP，ACP，Na+，K+-ATPase，Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase等酶活性的降低．上述結(jié)果表明，氟能透過血睪屏障作用于睪丸組織，導(dǎo)致生殖內(nèi)分泌功能紊亂，相關(guān)酶類活性改變．文獻(xiàn)［17］報(bào)道，氟化物可通過對(duì)生殖系統(tǒng)多方面的影響導(dǎo)致雄性大鼠生殖系統(tǒng)不可逆的損害．

硒對(duì)維持人體健康具有非常重要的作用．硒可提高氟中毒患者體內(nèi)抗氧化酶的活性，防止脂質(zhì)過氧化，促進(jìn)體內(nèi)過多的氟經(jīng)尿液排出體外，顯著降低了血液和睪丸組織中的氟含量．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步表明硒在一定范圍內(nèi)可拮抗氟對(duì)大鼠睪丸的毒性作用．從以往的報(bào)道中可以推測(cè)，其作用機(jī)制可能有以下幾個(gè)方面:首先，硒可以通過降低細(xì)胞膜對(duì)氟的通透性來減少細(xì)胞內(nèi)的氟含量，促進(jìn)氟的排出，減輕氟引起的脂質(zhì)過氧化損傷，使機(jī)體內(nèi)某些抗氧化酶類的活性增強(qiáng)，從而拮抗高氟的細(xì)胞毒作用［18］．其次，硒可以拮抗氟所致的生化指標(biāo)的改變．乳酸脫氫酶(LDH)屬于糖酵酶系，與生精上皮的成熟有關(guān)，廣泛存在于生精小管內(nèi)，主要參與生精細(xì)胞的能量代謝．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染氟組大鼠的LDH活性較對(duì)照組明顯地下降，其機(jī)制可能是氟作用于LDH導(dǎo)致其構(gòu)象改變，使LDH活性下降［19］，從而阻礙了生精細(xì)胞的能量供給，并導(dǎo)致精子細(xì)胞逐漸發(fā)生變性，影響到精子的形成與激素的分泌．硒可明顯地恢復(fù)氟所致的睪丸組織LDH活性的下降，其劑量不同使其對(duì)氟生殖毒性拮抗作用的效果也不同．本實(shí)驗(yàn)表明，在一定范圍內(nèi)，拮抗的效果會(huì)隨著硒劑量的增加而變得明顯．

AKP主要存在于胚胎期初級(jí)精母細(xì)胞、精原細(xì)胞和各級(jí)生精細(xì)胞與支持細(xì)胞交界面上，參與睪丸生殖細(xì)胞的分裂、分化與增殖時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸［18］．ACP主要分布于睪丸支持細(xì)胞的胞漿內(nèi)，其活性可能與其吞噬功能有關(guān)，并可作為衡量機(jī)體是否有生精障礙的指標(biāo)［19］．本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn):氟使大鼠睪丸組織中的AKP和ACP活性下降，當(dāng)加硒后，氟加低、高硒組大鼠睪丸中AKP活性有一定的升高，氟加中硒組有明顯的升高甚至超過了對(duì)照組，然而，ACP的活性雖有升高卻并沒有顯著的變化(P＞0．05)．這表明不同的標(biāo)志酶對(duì)于硒拮抗作用的敏感性不同．

ATP酶是一種和能量代謝密切相關(guān)的酶，3種ATP酶在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、收縮、代謝、調(diào)節(jié)等生命活動(dòng)方面具有重要的作用，而睪丸內(nèi)微環(huán)境對(duì)于精子生長、發(fā)育和成熟及功能完成至關(guān)重要［20］．有研究［21］表明，硒可以使血清和組織中的鈣鎂含量升高，對(duì)氟誘導(dǎo)的鈣鎂含量降低有顯著的拮抗作用．已知鎂是多種酶的必需成分或激活劑，故硒對(duì)氟致體內(nèi)鈣鎂降低的拮抗作用在維持機(jī)體正常功能方面有重要的意義．本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):Na+，K+-ATPase活性是高硒組及氟加高硒組較對(duì)照組明顯地降低，存在顯著差異(P＜0．05)，其他組有一定程度的降低，但與對(duì)照組沒有顯著差別，氟加中硒組更是與對(duì)照組相近;Mg2+-ATPase活性，染氟組與對(duì)照組比較有所降低，但差異尚不顯著(P＞0．05)，其影響還不如硒組和氟加高氟組;對(duì)Ca2+-ATPase活性，中硒組和氟加高硒組明顯高于對(duì)照組(P＜0．05)，其余各組尚未見差異(P ＞0．05)．總體上說明飲用50 mg/L氟化鈉對(duì)大鼠附睪ATP酶活性的影響較小，而硒對(duì)ATP酶的活性產(chǎn)生了一定影響，這與白曉琴等［20］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)硒對(duì)大鼠附睪ATP酶活性的影響相符．

綜上所述，氟中毒干擾了大鼠睪丸組織的正常生理生化功能，而硒在一定范圍內(nèi)通過特定的機(jī)制對(duì)氟致大鼠雄性生殖毒性產(chǎn)生了明顯的拮抗作用，但當(dāng)加硒量超出一定范圍后可能會(huì)產(chǎn)生一定的協(xié)同作用．本研究還發(fā)現(xiàn)，不同的生物標(biāo)志酶對(duì)于染毒所造成影響的敏感度不同，這為今后研究生殖毒性的生物標(biāo)記物提供了一定的科學(xué)論據(jù)和研究方向．硒對(duì)氟致生殖毒性拮抗作用的最佳劑量范圍及其拮抗機(jī)理尚需進(jìn)一步研究．

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