表面增強拉曼散射技術鑒別大腸桿菌和志賀氏菌的研究

呂 璞,龔繼來*,王喜洋,曾光明,崔 卉,胡家文 (.湖南大學環境科學與工程學院,環境生物與控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 4008；.湖南大學化學化工學院,湖南 長沙 4008)

表面增強拉曼散射技術鑒別大腸桿菌和志賀氏菌的研究

呂 璞1,龔繼來1*,王喜洋1,曾光明1,崔 卉2,胡家文2(1.湖南大學環境科學與工程學院,環境生物與控制教育部重點實驗室,湖南 長沙 410082；2.湖南大學化學化工學院,湖南 長沙 410082)

以整個大腸桿菌和志賀氏菌為研究對象,通過和納米銀顆粒混合制片,利用表面增強拉曼效應檢測并區分大腸桿菌和志賀氏菌.結果表明,未與納米銀顆粒混合的大腸桿菌和志賀氏菌沒有明顯的拉曼信號,而與納米銀顆粒混合后有明顯的拉曼信號,二者有明顯的區別,且重現性良好,可為鑒別大腸桿菌和志賀氏菌病原體研究及實際應用提供依據.

表面增強拉曼散射；納米銀顆粒；大腸桿菌；志賀氏菌

近年來,微生物污染已經滲透到水和食物方面,而且特定微生物引發的疾病也越來越多,因此快速的微生物檢測方法受到廣泛關注.目前,傅里葉變換紅外光譜[1],利用表面等離子共振的免疫傳感器[2],用特定探針的光纖DNA芯片技術[3]及熒光光譜[4-5]均應用于微生物的快速檢測.

從1974年發現至今,由于表面增強拉曼散射技術與其他方法相比,具有靈敏度高,選擇性強,特異性好等優點,已被廣泛用于臨床醫學、生物化學、生物技術、環境、考古等多個領域.隨著生物技術的發展及微生物污染的嚴重化,利用SERS技術檢測微生物的研究也越來越多.

2002年,Cao等[6]采用核酸分子雜交技術同時檢測了A型肝炎、B型肝炎、艾滋病、埃博拉病毒、天花病毒和Bacillus anthracis抗原等6種病原微生物.2005年,Zhang等[7]利用SERS傳感器快速檢測炭疽熱生物標志物. 2010年,Knauer等[8]利用SERS直接檢測水環境中的嗜肺軍團菌和沙門氏菌.Knauer等的研究和其他的研究有所不同,是以整個微生物為研究對象,這就是所謂的“whole-organism fingerprinting”技術[9].然而這些研究所報道的方法樣品前處理比較麻煩,花費時間較長.為此,本研究在“whole-organism fingerprinting”技術基礎上,以整個大腸桿菌和志賀氏菌為研究對象,把納米銀顆粒和細菌簡單地混合在硅片上,利用細菌與納米銀接觸時產生的 SERS快速檢測與辨別大腸桿菌和志賀氏菌.大腸桿菌是環境水質監測和食品安全中重要的指示微生物[10].志賀氏菌是最常見的腸桿菌科的病原菌,可通過水和食品傳播腹瀉及痢疾等疾病[11].因此對這2種菌的檢測具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

分析純試劑:無水乙醇,丙酮,氯仿,氯化鈉,氫氧化鈉,硝酸銀,二水合檸檬酸鈉;生化純試劑:蛋白胨,瓊脂粉,牛肉膏粉;pH值 7.2的磷酸鹽緩沖液,硅片.

TGL-16A臺式高速冷凍離心機(長沙平凡),純水自動裝置(上海申生),B220S-T型超洗器(上海必能),1-10RIBA 激光共聚焦拉曼光譜儀(JOBIN YVON,法國),微量移夜器(上海求精),恒溫恒濕培養箱 LRH-250-SⅡ(廣東醫療),振蕩培養箱LRH-250-SⅡ(廣東醫療).

1.2 細菌的購買及培養

志賀氏菌(CCTCC AB200058)從中國典型培養物保藏中心購買,大腸桿菌(DH-5α)是本實驗室準備的.

大腸桿菌培養基的配制:牛肉膏粉,3g/L;蛋白胨,10g/L;瓊脂粉,12g/L;氯化鈉,5g/L;pH,7.2～7.4.志賀氏菌培養基的配制:牛肉膏粉,3g/L;蛋白胨,5g/L;瓊脂粉,20g/L;氯化鈉,5g/L;pH,7.0. 2種菌分別按照各自的培養基在生化培養箱中37℃培養 24h,馴化 3次后,然后用液體培養基(不加瓊脂粉)在生化振蕩培養箱中 37℃培養48h.

1.3 納米銀顆粒的合成

納米銀顆粒采用文獻[12]合成:將250mL的5.29×10-4mol/L的硝酸銀水溶液加熱至沸騰,在劇烈攪拌下迅速加入7mL質量分數為1%的檸檬酸鈉水溶液,保持沸騰狀態反應 1h后,自然冷卻至室溫,溶液呈黃綠色.將制好的溶液放于冰箱內4℃保存.

1.4 樣品的制備及測定

1.4.1 硅片的洗滌 將切割好的小硅片放在小燒杯中,把小燒杯置于超聲波清洗機中,依次用超純水—乙醇—丙酮—氯仿—丙酮—乙醇—超純水清洗,每種溶液都清洗8min.

1.4.2 細菌的處理 液體培養基培養后的大腸桿菌和志賀氏菌,取適量培養液 4000r/min離心10min,棄上清液,用pH值7.2的磷酸鹽緩沖液清洗兩次,然后用無菌水清洗若干次后加入無菌水稀釋到1mL.

1.4.3 納米銀顆粒的處理 取上述制備的納米銀溶液30mL加入到50mL的離心管里,加入少量的表面活性劑,4000r/min離心 5min,棄上清液至剩余液體為1mL.

1.4.4 測定樣品的制備 取上述處理過的細菌液0.5mL和離心過的納米銀溶液0.5mL加入到1.5mL的離心管,充分混合后,4000r/min離心5min,棄上清液至剩余溶液約為 50μL.然后把這個混合液體取5μL滴加到清洗過的小硅片上.晾干后測定拉曼信號.

1.4.5 拉曼信號的測定 用鑷子將小硅片放到載物臺的玻璃片,直接用50倍長聚焦物鏡進行聚焦,測量時波長掃描范圍為:400～2000cm-1,掃描 1次.掃描時間為 1s,濾光片密度為 1D,進行mapping掃描,激發波長為632nm.

1.4.6 空白實驗 按照上述測量過程分別測定(1)干凈的硅片的拉曼信號;(2)取0.5mL離心過的納米銀再在相同條件下離心一次的拉曼信號;(3)離心處理過的不加納米銀的 2種菌的拉曼信號.

2 結果與分析

2.1 納米銀顆粒的TEM表征

圖1 納米銀顆粒的TEM圖譜Fig.1 TEM image of silver colloid

納米銀顆粒的制備采用檸檬酸鈉還原法制備,尺寸為 40～100nm,平均尺寸約為 55nm,其透射電子顯微鏡如圖1所示.納米銀的合成受還原劑加入量的影響,其粒徑隨著檸檬酸鈉加入量的增加而變大,形貌也逐漸不規則[13].因此可以從圖中觀測到納米銀的形狀多樣化,有圓形,棒狀,三角形.

2.2 細菌的SEM表征

由圖2可以看出,大腸桿菌和志賀氏菌都是桿狀的,大腸桿菌平均長度為 2.83μm,志賀氏菌平均長度為3.34μm.

圖2 大腸桿菌和志賀氏菌的SEM圖譜Fig.2 SEM image of Escherichia coli and Shigella spp.

2.3 細菌和納米銀顆粒混合的TEM表征

圖 3是大腸桿菌和志賀氏菌與納米銀顆粒混合液稀釋若干倍的情況下測得,從圖3可以看出,細菌被納米銀顆粒包圍,可以充分發揮納米銀顆粒的增強效果.

圖3 大腸桿菌和志賀氏菌與納米銀顆粒混合的TEM圖譜Fig.3 TEM image of the mixture of Escherichia coli and Shigella spp. and silver colloid

2.4 兩種細菌不同SERS信號分析

由圖 4可見,納米銀顆粒都幾乎沒有拉曼信號,而干凈的硅片在 520cm-1處有特定的硅信號.雖然未與納米銀顆粒混合的大腸桿菌和志賀氏菌的光譜圖有很大區別(圖 4),但是單獨的大腸桿菌和志賀氏菌的拉曼譜峰很少且信號很弱,和納米銀顆粒混合后納米銀顆粒圍繞在細菌周圍,拉曼譜峰增加,且信號得到增強.與納米銀混合后的兩種菌的拉曼信號有明顯的區別,除了520cm-1處的硅信號,大腸桿菌分別在 658cm-1,728cm-1, 960cm-1左右,1000cm-1左右,1330cm-1左右, 1460cm-1左右,1570cm-1左右有明顯的信號, 728cm-1的峰說明了大腸桿菌中含有 N-乙酰-D-葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸[14].在658cm-1的峰和Jarvis等[14]的研究結果相符合.而 1460cm-1和1570cm-1峰和Jarvis等[15]的另一項研究結果相符,且 Jarvis等在文獻[15]中報道大腸桿菌并沒有出現658cm-1這個峰,這可能是由于拉曼測定條件的不同,正如Jarvis等[16]敘述:一樣的大腸桿菌,就因為一個在波長 785nm測定拉曼信號,一個在532nm測定拉曼信號,兩者的信號峰位置大有不同.實驗拉曼信號的測定是在波長632nm,而Jarvis等是分別在波長785nm,532nm測定.志賀氏菌分別在 670cm-1左右,820cm-1左右,1330cm-1左右,1570cm-1左右有明顯的信號.兩種菌最明顯的區別在600～700cm-1之間.通過分析可以看出實驗可以測定并鑒別大腸桿菌和志賀氏菌2種菌.

圖4 納米銀和2種菌混合后及空白實驗的拉曼光譜Fig.4 Raman mapping spectra of bacteria and blank

2.5 硅片上的重現性實驗

分別對 2種菌的同一樣品和不同時間的樣品做mapping掃描分析,同一樣品做平行實驗,每個樣品測25個點,兩個平行樣50個點,有如圖5(a)和圖6(a)所示的拉曼信號的有32個點左右,不同時間的樣品間隔大概半個月左右測量拉曼信號,如圖5(b)和6(b)所示.通過對比可以看出2種菌在硅片上的拉曼信號有良好的重現性.

實驗中細菌是在水環境條件下,并且大腸桿菌和志賀氏菌都是水環境中常見的菌株,因此實驗條件與實際相接近,能夠為大腸桿菌和志賀氏菌的檢測方法的實際應用提供依據.

圖5 大腸桿菌重現性拉曼光譜Fig.5 Raman mapping spectra of Escherichia coli

圖6 志賀氏菌重現性拉曼光譜Fig.6 Raman mapping spectra of Shigella spp.

3 結論

3.1 單獨的大腸桿菌和志賀氏菌的拉曼譜峰很少且信號很弱,和納米銀顆粒混合后納米銀顆粒圍繞在細菌周圍,拉曼譜峰增加,且信號得到增強.

3.2 大腸桿菌和志賀氏菌與納米銀顆粒混合后測得的拉曼信號有明顯區別,說明這種方法能夠鑒別兩種菌.600～700cm-1之間區別最明顯,大腸桿菌在658cm-1處的拉曼信號峰和以前的研究相符合,由于測定條件不同,大腸桿菌在 728cm-1也有峰,這個峰說明大腸桿菌中含有N-乙酰-D-葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸.

3.3 兩種菌的同一樣品和不同時間的樣品的拉曼信號有良好的重現性.

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Detection and discrimination of Escherichia coli and Shigella spp. using surface-enhanced Raman spectroscopy.

Lü Pu1, GONG Ji-lai1*, WANG Xi-yang1, ZENG Guang-ming1, CUI Hui2, HU Jia-wen2(1.Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control,Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China；2.College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China). China Environmental Science, 2011,31(9)：1523～1527

E. coli and Shigella spp. were detected and differentiated using surface-enhanced Raman scattering (SERS) by preparing bacteria samples with silver colloids on a silicon surface. Results show that Raman signals of E. coli and Shigella spp. were negligible in the absence of silver nanoparticles, but observable and distinguishable spectra were collected while in the presence of silver nanoparticles. Thus, E. coli and Shigella spp. could easily be discriminated based on their different Raman spectra. The method in this work exhibited high reproducibility and showed great promise for the detection of E. coli and Shigella spp. in environmental samples.

surface-enhanced Raman scattering; silver colloid; Escherichia coli; Shigella spp.

X172

A

1000-6923(2011)09-1523-05

2011-01-20

教育部新世紀優秀人才支持計劃項目(NCET-09-0328)

* 責任作者, 副教授, jilaigong@hnu.cn

呂 璞(1986-),女,河南許昌人,湖南大學環境科學與工程學院碩士研究生,主要從事水質監測新技術研究.發表論文1篇.