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長期暴露于全氟十三酸的青鳉魚體內分布和生物富集

2011-12-21 00:52:24于艷艷胡建英趙硯彬北京大學城市與環境學院北京100871
中國環境科學 2011年9期

于艷艷,胡建英,彭 輝,萬 祎,趙硯彬 (北京大學城市與環境學院,北京 100871)

長期暴露于全氟十三酸的青鳉魚體內分布和生物富集

于艷艷,胡建英*,彭 輝,萬 祎,趙硯彬 (北京大學城市與環境學院,北京 100871)

研究了將青鳉魚長期暴露于不同濃度的全氟羧酸類物質全氟十三酸(PFTriDA)后的器官分布和富集系數.結果顯示, PFTriDA最高富集在性腺;其次是卵、肝臟;濃度最低的部分是殘體.除了性腺之外,該器官分布與野生中華鱘的一致.在相同暴露濃度下,雄魚體內各器官的PFTriDA的含量高于雌魚,機理模型計算進一步表明高母子傳遞系數是造成雌雄差異的可能原因.隨著PFTriDA暴露濃度的升高,魚體內同一器官的生物富集系數(BCF)呈現下降趨勢.

全氟化合物(PFCs);全氟十三酸(PFTriDA);器官分布;生物富集;青鳉魚

由于全氟化合物(PFCs)具有環境持久性、廣泛存在性和潛在的毒性,這類物質已經引起了廣泛的關注[1-2].但是到目前為止的研究更多地集中在全氟辛磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)物質上[3-4].全氟十三酸(PFTriDA)是全氟化合物中的一種長鏈全氟羧酸.野外調查證實[5],在中華鱘(Acipenser sinensis)體內,PFTriDA的濃度遠高于PFOS和PFOA,并且母子傳遞系數高達5.5,可能影響處于敏感時期的胚胎的發育.一些體外、體內毒性試驗也表明[6-8]長鏈全氟羧酸具有更強的細胞毒性,誘導肝臟中的氧化應激反應,抑制脂肪酸β-氧化及PPAR下游基因表達等生物毒性.

生物富集系數(BCF)反映了機體從周圍水環境中富集環境污染物的能力,是化學物質生態風險評價的關鍵因子之一[9].目前關于PFOS的研究發現,其在實驗室暴露條件下BCF值在210~5400之間[9-10].對于不同鏈長PFCs的BCF的研究表明,與相同碳鏈的羧酸類物質相比,磺酸類物質具有較大的BCF值;對羧酸類物質來說,BCF隨著鏈長的增加而增加[9].但到目前為止,尚沒有關于PFTriDA的BCF的報道.以往的BCF研究往往局限于比較短的暴露時間.考慮到野生生物不同于實驗室暴露,其終生暴露在化學物質之中,并通過母子傳遞導致生物體在最敏感的胚胎時期遭受高濃度的PFCs暴露而影響繁殖,因此有必要通過整個生命周期暴露PFTriDA研究子代的BCF.

本研究將剛孵出的青鳉魚暴露于不同濃度的PFTriDA至繁殖期,檢測PFTriDA在不同器官包括肌肉、肝臟、性腺和卵中的濃度,并計算了該物質在不同暴露濃度下的不同器官中的 BCF,為PFTriDA的生態風險評價提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 試劑

PFTriDA、全氟十二酸(Perfluorododecanoate Acid, PFDoDA),四丁基硫酸氫銨(TBAS)和二甲基亞砜(DMSO)購自 Sigma公司(Louis, MO, USA)、色譜純的甲醇和甲基叔丁基醚(MTBE)購自Fisher公司(New Jersey, USA).

1.2 暴露實驗

青鳉魚(Medaka, Oryzias latipes)屬于Orange-Red品系.養殖和暴露期間條件為水溫(25±1)°C,水硬度(以 CaCO3計)(81.1±1.2)mg/L, pH7.9±0.1,DO (7.8±0.3)mg/L.光周期控制在晝:夜=16h:8h.飼料為新孵化的活體鹵蟲幼體,每天喂2次.

采用剛孵化的青鳉魚苗(0dph),暴露至繁殖期,約80d.PFTriDA配制成濃度為2500mg/L的DMSO溶液后,按梯度稀釋,以 DMSO溶液/水=0.002%(體積比)比例配制實驗暴露用水.設計了6個PFTriDA暴露濃度梯度:0(對照組,用于去除背景值),0.04,0.2,1.0,5.0和50.0μg/L.每組養殖20對青鳉魚(雌雄各20條),設2個重復.最初30d放在2L的結晶皿中,養殖水體積為1.5L,每天半量換水.后期每組挑選 16對發育較好的青鳉魚(雌雄各 16條)放置在方缸,采用流水裝置,養殖水體積為14L,每天流動的水量為14L.暴露期間,每隔1周從各個實驗組取100mL養殖水,用于檢測 PFTriDA的實際暴露濃度;暴露至繁殖期約80d,清晨光周期開始0.5h后,分別從各暴露組中隨機選擇 3條產卵的雌魚,采集魚卵,用吸水紙分別吸干魚體表和魚卵水分,分別稱重,隨后解剖取肝臟和性腺及余下的殘體并分別稱重,同時隨機選擇 3條雄魚,與雌魚處理方式相同.樣品均保存在-20℃,用于分析不同器官中的PFTriDA濃度.

1.3 濃度分析

低濃度組(0,0.04,0.2,1.0μg/L)水樣用離心機以9000r/min的轉速離心10min.取上清液100mL,加入內標PFDoDA后用Waters Oasis WAX(6cc, 500mg)萃取柱進行富集.上樣前,依次用 4mL含有 0.5%(體積比)氨水的甲醇溶液、4mL的甲醇和4mL的純水活化WAX柱,然后以約10mL/min的速率上樣.然后用4mL的0.025mol/L乙酸鈉溶液(pH4)淋洗WAX柱以去除部分雜質,然后用氮氣將其吹干.再用4mL含有0.5%(體積比)氨水的甲醇溶液洗脫,氮吹濃縮至1mL,富集倍數為100倍.萃取液用 GHP濾器過濾后進入 UPLC-MS/ MS分析.

高濃度組(5.0和50.0μg/L)水樣,采用液液萃取的方法進行樣品預處理.水樣用離心機以9000r/min的轉速離心10min.取上清液500μL水樣到15mL的聚丙烯離心管,加入內標PFDoDA后依次加入1mL的0.5mol/L的TBAS溶液,2mL的 0.25mol/L的碳酸鈉溶液,混合均勻后加入5mL的MTBE,然后300r/min振蕩30min后,超聲波振蕩20min.3600r/min離心10min后,用巴氏吸管將上層有機相轉移到另一個 15mL的聚丙烯離心管中,重復提取過程2次并將上層有機相合并,氮吹濃縮至1mL.萃取液用GHP濾器過濾后進入UPLC-MS/MS分析.

1.4 生物樣品處理

將各種生物樣品進行組織勻漿后轉移到15mL的聚丙烯離心管,其余操作與高濃度組水樣處理方式相同.

1.5 LC-MS-MS分析

目標物質分離采用ACQUITY UPLC液相色譜儀(Waters, USA).為了消除UPLC管路和流動相中本身存在的 PFCs對目標物質測定的干擾,將一根50mm的ACUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7μm粒徑,2.1mm×50mm,Waters, USA)聯接于溶劑混合器(Filter Mixer)與進樣器六通閥之間,使UPLC中的PFCs雜質在與樣品混合之前先于該色譜柱上保留一段時間從而與樣品中的目標物質相分離.PFCs的分離采用 100mm 的ACUITY UPLC BEH C18色譜柱(1.7μm 粒徑,2.1mm×100mm,Waters,USA).流動相為甲醇與含5mmol/L乙酸銨的純水,流速為0.2mL/min.采用梯度分離,甲醇的比例在6min內從10%線性提高到65%,然后在1min內線性提高到75%,在以后的4min內提高到100%,保持2min后回到初始比例平衡3min.柱溫為40℃,進樣體積為5μL.

目標物質定量采用Quattro Premier XE串聯四級桿質譜聯用儀(Waters Corp.,USA).質譜采用ESI負離子源,MRM 監測模式.質譜操作參數設定:毛細管電壓 2.5kV;錐孔電壓 30V;倍增電壓650V;脫溶劑氣流量 800L/h;錐孔氣流量 50L/h;源溫度110℃;脫溶劑氣溫度350℃.

1.6 質量控制

加標回收率分別用未暴露的水樣和魚樣進行.在 500mL自來水中加入 200ng/L的PFTriDA(n=3),用固相萃取柱富集,回收率為81%±10%,方法檢出限為 0.5ng/L,樣品內標回收率為 71%~97%;對于水樣的 MTBE萃取方法(n=3),在500μL自來水樣中加入5μg/L PFTriDA,加標回收率為 94%±7%,方法檢出限為 0.5μg/L,樣品內標回收率為79%~119%;在0.3g魚體樣品中加入1μg/g PFTriDA(n=3),然后用MTBE萃取,加標回收率為86%±12%,方法檢出限為1ng/g,樣品內標回收率為67%~114%.

為了消除方法空白,所用的器皿都分別用甲醇沖洗3次.另外每批樣品都帶1空白樣品,結果表明整個實驗過程沒有空白,并獲得了很好的儀器標準線(0,20,40,80,160,320,640,1200和 2400 pg/mL,R2>0.99).

1.7 生物富集模型計算及數據分析

魚體中的污染物總量變化等于每天吸收的量再減去排出的量,可以用式(1)表示[11].

式中:Cb為魚體濃度;Cw為水體濃度;Gw為每天交換的水體;Ew為PFTriDA的吸收效率;Wb為魚體重; kd為排泄系數;kegg為母子傳遞系數;Wegg為卵的質量,當雄魚時Wegg=0,由于精子相對于卵質量很小,忽略不計.

慢性暴露的結果使PFTriDA基本處于平衡狀態,魚體濃度保持不變,則式(1)可改寫為式(2).

根據魚類代謝能量,Gw可由式(3)計算.

式中: MT為總代謝能量;Eox為氧氣利用率, 0.45[11];Cox為培養水體中氧氣含量.

MT和魚體的重量和溫度有關,可以用式(4)表示:

式中: T為絕對溫度,K.

而水中氧氣濃度由式(5)計算:

數據分析采用 SPSS統計軟件包.數據顯著差異分析采用獨立樣本 t檢驗,顯著性水平為0.05.所有數據和圖表均以“平均值±標準偏差”方式表示.

2 結果與討論

2.1 PFTriDA在青鳉魚體內器官分布

暴露期間養殖水中 PFTriDA的實測濃度(n=6,括號中數值為設計濃度)分別為 0.08± 0.03(0.04)、0.25±0.07(0.2)、1.32±0.20(1.0)、5.17± 4.23(5.0)和43.72±6.87(50.0)μg/L.

PFTriDA在雌魚體內不同器官中的濃度順序是性腺>卵>肝臟>殘體(圖1),除了性腺之外,其器官分布與野生中華鱘一致[5].除最高暴露濃度組(50.0μg/L)外,雌魚性腺中 PFTriDA濃度高于魚卵中濃度.這是因為在本實驗中雖然雌魚性腺充滿了各個時期的卵細胞,但成熟卵細胞在排出體外時會吸水導致體積有所增加,從而使卵中PFTriDA的濃度要低于性腺中濃度.母子傳遞系數(ELR)用卵中PFTriDA的濃度和母體肝臟中濃度的比值來表示[5].PFTriDA在0.04,0.2,1.0,5.0和50.0μg/L的暴露濃度下,母子傳遞系數分別為1.51±0.60,1.00±0.47,1.25±0.33,0.92±0.26和6.79± 0.92.值得注意的是在 50.0μg/L暴露組,PFTriDA的母子傳遞系數高達 6.79,甚至超過野生中華鱘的5.5,有關機理需要進一步研究.

圖1 不同暴露濃度下各器官PFTriDA 的濃度Fig.1 PFTriDA concentrations in different tissues at different exposure concentrations

在相同暴露濃度下雄魚體內各器官的PFTriDA的濃度高于雌魚(圖1),特別是50.0μg/L暴露組中雌魚體內的PFTriDA濃度遠低于雄魚,這一結果與PFOA暴露黑頭呆魚的結果相似[12],但是卻不同于 PFOS暴露黑頭呆魚的結果[13].一些相關研究闡述了PFCs在雌雄魚體內的差異性富集.Schult等[12]進行了經口攝入PFOA后,其在黑頭呆魚體內的吸收和排泄的性別差異的研究,認為性激素誘導的有機陰離子轉移通道的變化導致了 PFOA在魚體內包括腎小管重吸收和分泌的腎運輸活性的雌雄差異,從而使得PFOA在雌魚體內的清除速率遠遠大于雄魚.這一結果與實驗室暴露大鼠的結果一致[14-15].而Gerald等[13]也認為是化學物質排泄速率的性別差異導致了PFOS在雌雄魚體內濃度的差異.并通過驗證試驗發現,PFOS、PFOA、PFDA、PFDoDA這4種物質在雄性虹鱒魚體內的排泄速率要遠高于雌魚,導致雄魚體內濃度低于雌魚.這與本研究的結果相反.另外,母子傳遞也可能是導致 PFCs雌雄差異性的主要原因.Greg等[10]通過實驗室暴露發現,斑馬魚經歷過1個生殖周期后成魚體內大約10%的PFOS通過母子傳遞的方式傳遞到魚卵中,使得魚卵中PFOS的濃度[(116±13.3)μg/g]遠高于成魚[(72.1±7.6)μg/g].青鳉魚雌魚性成熟之后在雄魚的刺激下,每天都會產卵,而PFTriDA的高母子傳遞系數可能使雌魚通過卵排泄大量的PFTriDA,從而導致雌魚體內PFTriDA濃度低于雄魚.

表1 長期暴露后PFTriDA在青鳉魚不同器官的生物富集系數(BCF)Table 1 Bioconcentration factor (BCF) of PFTriDA in different tissues of medaka after long-term exposure

2.2 PFTriDA在青鳉魚卵及其他器官中的BCF

表1列出了PFTriDA暴露80d后在青鳉魚不同器官的BCF.PFTriDA在雌魚體內的BCF是11.0~686.6,低于其在雄魚體內的 BCF(12.6~1046.4).由于 PFCs具有很強的親水性(pKa<0.5)[16],以及優先與蛋白質結合,使得其富集機理不同于傳統的持久性有機污染物的親脂性分配過程,可能是由于與體內不同器官的蛋白質結合導致.例如有研究表明[17-18,25],PFCs在肝臟中的高濃度富集是因為與肝臟中的蛋白如肝臟脂肪酸結合蛋白(L-FABP)結合.而 PFCs在卵中的高濃度富集原因目前尚不清楚,Peng等[5]發現,PFCs的母子傳遞系數和蛋白結合能力有顯著相關性,表明 PFCs在魚卵中的高濃度富集可能也是同一些蛋白如卵黃蛋白結合導致.

在最低的暴露濃度組(0.04μg/L),PFTriDA在青鳉魚雌魚和雄魚肝臟中的BCF分別為1260.1± 871.8和2940.80±1793.03,遠低于Martin等[9]的虹鱒幼魚短期暴露實驗中 PFUnA、PFDoDA和PFTA(暴露濃度分別為 0.48,0.20和0.014μg/L,在肝臟中的BCF分別為4900,18000和30000)的BCF,但是和 PFDA(暴露濃度為 0.71μg/L,在肝臟中的BCF為1100)的BCF相似.根據Martin等[9]的實驗數據,發現全氟羧酸在虹鱒幼魚肝臟中的 BCF隨著碳鏈的增加而增加,這樣PFTriDA的BCF應該介于PFDoDA和PFTA的BCF之間,即18000~30000.這可能與實驗動物的物種差異性或暴露用魚的生長期及暴露時期的選擇有關.

圖2 青鳉魚不同器官中PFTriDA的暴露濃度與BCF之間的相關性Fig.2 Ln-linear correlation between exposure concentrations of PFTriDA and BCF in different tissues of medaka

PFTriDA在相同器官中的BCF隨著暴露濃度的增加而減小,暴露濃度與BCF之間有顯著的對數線性相關性(圖2).這一現象在以往的其他物質PCP、2,4-DCP、TBT和4-NP研究中也有類似報道,是影響評價野外生物富集性及生態效應的重要因素[19-21].而對本實驗而言,可能是因為高濃度下的PFTriDA暴露使得體內的血清白蛋白等與PFTriDA的結合能力趨近飽和(接近文獻報道的體外實驗濃度5μmol/L[22]),從而使游離態比例升高而增加排泄能力、降低富集系數.這一研究結果說明以往的高濃度暴露實驗數據不能簡單外推到野外環境中,而本研究為評價環境中PFTriDA的BCF提供了理論基礎.

2.3 青鳉魚雌雄魚體內濃度預測及解析

在長期暴露的穩態假設下,根據方法 1.7中所列方程(1-5)并結合相應的暴露濃度,對青鳉魚雌雄魚體內PFTriDA的濃度進行了預測.由于文獻中報道的排泄常數kd值[11]是在與0.04μg/L相似的濃度下獲得,為此對0.04μg/L暴露組青鳉魚體內濃度進行了預測.表2列出了用于計算的各參數值.最終雌雄魚體內的PFTriDA的預測濃度分別為 77.8,280.4ng/g,與魚體內的實測濃度(雌魚101.1,雄魚236.4ng/g)比較接近(圖3).

表2 青鳉魚雌雄魚體內濃度預測的各種參數Table 2 Parameters used to predict the internal concentration of PFTriDA in medaka

目前關于PFCs在生物體內的性別差異性富集已經在大鼠、魚體內報道,其中激素水平對陰離子轉運蛋白的競爭作用可能是導致某些物種PFCs性別差異的重要原因[12,14].然而在具有高母子傳遞系數的卵生生物中,母子傳遞過程可能是導致性別差異性富集的另一重要原因[23].而本研究預測結果和實測結果都表明,PFTriDA在雌魚中的富集濃度遠低于雄魚,通過計算得到雌魚通過母子傳遞排泄的PFTriDA的量在總排泄量中所占的比重高達 65.3%,從而也證明母子傳遞是導致雌雄富集能力的差異性原因之一.

圖3 0.04μg/L暴露組青鳉魚雌雄魚體內濃度預測值和實測值比較Fig.3 Predicted value and measured value of internal concentration of PFTriDA at 0.04μg/L treatment in medaka

3 結論

3.1 PFTriDA濃度最高的器官是性腺,其次是卵、肝臟,而在包括鰓、腦、腸道、肌肉等部分的殘體中的PFTriDA濃度最低.

3.2 在相同暴露濃度下,雄魚體內各器官的PFTriDA的含量高于雌魚,根據機理模型的計算結果推斷,高母子傳遞系數可能是造成雌雄差異的原因之一.

3.3 隨著 PFTriDA暴露濃度的升高,青鳉魚體內同一器官的生物富集系數(BCF)呈下降趨勢,這可能是導致風險評價出現偏差的重要原因.

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Tissue distribution and bioconcentration of long-term exposure to perfluorotridecanoate acid (PFTriDA) in the medaka (Oryzias Latipes).

YU Yan-yan, HU Jian-ying*, PENG Hui, WAN Yi, ZHAO Yan-bin (College of Urban Environmental Sciences, Peking University, Beijing 100871, China). China Environmental Science, 2011,31(9):1548~1554

While perfluorotridecanoate acid (PFTriDA), a long-chain perfluorinated carboxylic acid, has been widely detected in environment and wildlife in recent years, there is still lack of mechanism information on the tissue distribution and bioconcentration in fish. The tissue distribution and bioconcentration in the medaka (Oryzias Latipes) exposed to different concentrations of PFTriDA was assessed. The highest concentration of PFTriDA was detected in gonad, followed by egg, liver and carcass, which was similar to the tissue distribution in wild Chinese Sturgeon (Acipenser sinensis) except for gonad. For all tissues, male accumulated higher concentrations than female, which was demonstrated to be mainly due to high maternal transfer efficiency in adult female. The bioconcentration factor (BCF) was found to be decreased with increasing the exposure concentration of PFTriDA.

perfluorinated compounds (PFCs);perfluorotridecanoate acid (PFTriDA);tissue distribution;bioconcentration;medaka

X503.225,X835

A

1000-6923(2011)09-1548-07

2010-12-13

國家“973”項目(2007CB407304)

* 責任作者, 教授, hujy@urban.pku.edu.cn

于艷艷(1985-),女,山東文登人,山東師范大學生命科學學院碩士研究生,北京大學城市與環境學院客座研究生,研究方向為PFCs毒性效應及機制.

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