脈沖LED激發羅丹明B瞬態熒光光譜特征

葉明樹，田治富，胡慶，莊其仁

（華僑大學 信息科學與工程學院，福建 泉州 362021）

脈沖LED激發羅丹明B瞬態熒光光譜特征

葉明樹，田治富，胡慶，莊其仁

（華僑大學 信息科學與工程學院，福建 泉州 362021）

采用發光二極管（LED）脈沖光源作為激發光，研究羅丹明B熒光的瞬態光譜特征.激發光源為3個中心發射波長分別為406，464和528nm的超高亮紫光、藍光和綠光LED.實驗結果表明：不同激發光顏色（波長）、不同脈沖寬度和不同羅丹明B濃度得到的熒光強度有很大差別；在同一濃度下，激發光持續時間（脈沖寬度）小于10ms，只有綠光激發能產生強的熒光，紫光和藍光不能產生熒光；而脈沖寬度大于20ms時，紫光和藍光激發有熒光出現，但強度都比綠光激發時小很多，并且藍光激發時熒光最弱.采用合適脈沖寬度的紫光、藍光和綠光LED作為激發光源，可以得到羅丹明B的特征熒光光譜 .

發光二極管；羅丹明B；熒光光譜；脈沖寬度

傳統的熒光儀器大多采用脈沖氙燈、激光器、汞燈等作為激發光源，不僅需要高壓供電，而且體積大、成本高，無法滿足實時原位監測的要求.近年來，隨著發光二極管（LED）技術和工藝的不斷提高，各種超高亮、短波長的LED不斷出現，使得LED的發射波長幾乎覆蓋了整個近紫外－近紅外光譜區，有望取代傳統激發光源［1-2］.然而，熒光光譜儀由于受到激發光源、單色儀和探測器的光譜特性的影響，其熒光光譜（激發光譜和發射光譜）并不是所研究物質的真實光譜，而要得到物質的真實光譜，一般要采用羅丹明B法［3-5］對實驗光譜進行校正.羅丹明B熒光染料具有光穩定性好，對pH值不敏感，較寬的波長范圍和較高的熒光量子產率等優點，是分析化學和生物醫藥科學等生物技術領域中最常用的熒光染料.已有的文獻中，采用常規光源和分光光度計法測量羅丹明B二維及三維熒光光譜的報道較多［6-9］.司馬偉昌等［10］報道了采用多波長LED陣列誘導羅丹明B的熒光發射光譜.本文采用電子快門控制光脈沖，研究LED激發羅丹明B熒光的瞬態光譜特征.

1 實驗方法

圖1為實驗裝置原理圖，由LED激發光源、樣品池、聚焦透鏡和光纖光譜儀共同組成.激發光源為中心發射波長分別為406，464和528nm的3個超高亮紫、藍、綠發光二極管（LED），直徑均為5mm，LED為半球形封裝，具有較小的光束發散角（小于15°），樣品池大小為12mm×12mm×450mm.

激發光從一個方向入射樣品池，在垂直方向上由焦距50mm的聚焦透鏡收集熒光，在焦點處為USB 4000型光纖光譜儀（美國Ocean Optics公司）的光纖入射端面，最后由計算機進行數據處理.LED光源采用恒流驅動輸出，幅度穩定，激發光脈沖通過1／1 000s的電子快門控制，激發光脈沖寬度控制為50ms.

圖1 實驗裝置原理圖Fig.1 Experimental schematic diagram

實驗所用工作液采用母液逐級稀釋得到 .首先取0.50g羅丹明B用少量水溶解，于500mL容量瓶中定容，然后取1mL羅丹明B溶液在量筒中稀釋，再進行熒光測定.光纖光譜儀的積分時間是5ms，光譜儀的工作方式設定為外部觸發，觸發信號由控制電子快門的單片機發出.由于電子快門開啟跟關閉相對于光譜儀都有延遲，所以電子快門跟光譜儀的開啟時間誤差會前后相減延遲而抵消，達到整個系統的時間同步.Atmega16單片機（美國Atmel公司）系統時鐘設定為8MHz，以減少定時時間誤差.

2 結果和分析

2.1 LED光源的發射譜

紫光、藍光和綠光LED的發射光譜，如圖2所示.3種LED光源的中心發射波長分別為406，464和528nm，峰值相對光強度相差不大（約62 000單位），光譜半高全寬分別為25，33和45nm.并且，528 nm綠光LED的發射光譜基本覆蓋了羅丹明B最大量子產率的554～566nm激發波長范圍［6］.

2.2 瞬態熒光光譜特征

分別用上述紫光、藍光和綠光LED光脈沖激發羅丹明B溶液（質量濃度為0.5g·L－1），其瞬態熒光光譜分別如圖3～5所示.

從圖3（a）可看出：紫光脈沖激發羅丹明B溶液時，熒光峰值波長在625nm左右，熒光強度逐漸增強，25 ms熒光峰值達到穩定的最大值，其相對光強度約3 000個單位，25ms后，長波長的熒光強度繼續增大，40ms后熒光光譜基本穩定不變.從圖3（b）可看出，當紫光脈沖熄滅后，熒光強度急劇下降，5ms后熒光強度就下降到最大值的一半以下，并且峰值波長和短波長部分下降速度最快，長波長熒光強度下降速度較慢.

從圖4（a）可知：藍光激發羅丹明B熒光有很大的延遲，在激發光入射20ms后才有明顯的熒光出現，并且強度很低.20ms的熒光光強緩慢增長，45ms的熒光強度才達到最大，但幅度很小，峰值約1 750個單位.從圖4（b）可以看出，藍光激發的羅丹明B熒光的消失也比較緩慢.

從圖5（a）可以看出：與紫光和藍光激發羅丹明B熒光比較，綠光激發的熒光出現速度最快，10ms就有很明顯的熒光出現，其峰值約3 000個單位；10ms的熒光強度達到最大，其峰值約9 600個單位，10ms后的熒光光譜向長波長展寬.從圖5（b）可以看出，綠光激發的熒光在激發光熄滅后強度快速下降，10ms后已下降至最大值的5%以下.

圖2 3種LED光源的發射光譜Fig.2 Emission spectrum of three LED sources

圖3 紫光LED瞬態熒光光譜Fig3 Transient fluorescence spectra excited by the purple LED light pulse

圖4 藍光LED瞬態熒光光譜Fig.4 Transient fluorescence spectra excited by the blue LED light pulse

圖5 綠光LED瞬態熒光光譜Fig.5 Transient fluorescence spectra excited by the green LED light pulse

2.3 羅丹明B熒光與激發光脈沖寬度的關系

不同質量濃度的羅丹明B被紫色、藍色和綠色LED激發出熒光的時間和熒光的熄滅時間并沒有明顯的不同，但是在熒光峰值和峰值中心卻有著很大的差異.紫色、藍色和綠色LED激發不同質量濃度（ρ）的羅丹明B的熒光光譜，如圖6所示.

從圖6可知：不同質量濃度的羅丹明B被紫色、藍色和綠色LED激發出的熒光光譜同樣在25，45和10ms時峰值達到最大.在羅丹明B濃度增加的情況下，光譜的峰值逐漸降低，而且熒光中心都明顯的紅移了.發射波長發生紅移可能是由于溶液質量濃度過大，羅丹明B發生聚集狀態形成了二聚體或多聚體后，導致能量在組分分子間來回轉移，延長了分子在發生熒光之前的壽命［11］.同時，由于可能存在的自熄滅作用增強，所以體系的熒光強度隨著羅丹明B質量濃度的增加反而減小.

根據實驗結果，羅丹明B的熒光光譜不但與激發光波長有關，還與激發光持續時間有關.從圖6還可以看出，不同激發光顏色（波長）和脈沖寬度得到的羅丹明B熒光強度有很大差別 .當激發光持續時間（脈沖寬度）小于10ms時，只有綠光激發能產生強的熒光，紫光和藍光不能產生熒光；當脈沖寬度大于20ms時，紫光和藍光激發有熒光出現，但強度都比綠光激發時小很多，并且藍光激發時熒光最弱.

圖6 不同質量濃度的羅丹明B熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of rhodamine B in different concentrations

從圖5（a）還可以看出，激發光持續時間（脈沖寬度）小于10ms時，綠光激發產生的熒光光譜寬度窄，激發光持續時間增加，熒光光譜寬度變寬 .因此，采用合適的激發光持續時間（脈沖寬度）的紫光、藍光和綠光LED作為激發光源，可以得到羅丹明B的特征熒光光譜，如圖7，8所示.圖7，8中：激發光脈沖寬度為10ms.

圖7 熒光峰值強度跟激發光持續時間的關系Fig.7 Relationship between fluorescence peak intensity and excited light duration

圖8 羅丹明B的光譜特征 Fig.8 Characteristics of fluorescence spectra of rhodamine B

3 討論

上述實驗結果表明，羅丹明B熒光光譜中包含熒光和磷光［12-13］現象 .當激發光持續時間（脈沖寬度）小于10ms時，發光光譜主要為熒光光譜 .這是因為熒光壽命短，有激發源時會發光，激發源去除后，熒光就立即消失.當激發光脈沖寬度大于20ms時，紫光和藍光激發有熒光出現，綠光激發的熒光光譜展寬，主要向長波長展寬.這部分熒光包含了磷光成分，激發源去除后熒光依然存在（緩慢減弱）.因此，羅丹明B特征熒光光譜才是沒有磷光成分的純熒光光譜，該特征光譜可用于羅丹明B成分檢測和其他采用羅丹明B作為試劑的傳感領域.

瞬態熒光光譜測量方法，如采用波長連續可調的激發光源，就能得到羅丹明B的四維熒光光譜（激發－發射－時間－熒光光譜）.相比較于三維熒光光譜圖，羅丹明B的四維熒光光譜圖更能詳細描述被測組分的性質.

［1］吳震，錢可元，韓彥軍，等.高效率、高可靠性紫外LED 封裝技術研究［J］.光電子·激光，2007，18（1）：1－4.

［2］懷素芳，李旭.新一代照明光源白光LED 的發展概況［J］.物理通報，2007（11）：53－55.

［3］高勇，張敏，郭斌.羅丹明熒光探針在生化分析中的應用［J］.化學通報，2009，72（1）：15－19.

［4］賈佳，馬會民.新的羅丹明B類光學探針的研究［C］∥第15屆全國有機分析及生物分析學術研討會 .北京：中國化學會，2009.

［5］劉中仕，荊西平.熒光光譜的羅丹明B校正原理［J］.化學通報，2005，20（1）：771－775.

［6］黃保軍，李建軍，屈凌波.羅丹明B熒光光譜機理的研究［J］.天津師范大學學報：自然科學版，2005，25（3）：8－10.

［7］楊美玲，崔東亞，朱運德，等.金（Ⅲ）－羅丹明B－碘化鉀體系的熒光光譜分析［J］.陜西理工學院學報，2008，24（2）：75－77.

［8］魏永巨，康志敏，劉翠格，等 .羅丹明B的共振散射光譜研究［J］.光譜學與光譜分析，2004，24（12）：1659－1662.

［9］王雅娜，崔勵，馬杰，等.羅丹明B的三維熒光光譜研究［J］.染料與染色，2007，44（9）：57－59.

［10］司馬偉昌，張玉鈞，王志剛，等.多波長LED陣列誘導熒光光譜在多組分分析中的應用研究［J］.光譜學與光譜分析，2008，28（1）：105－168.

［11］KEMNITZ K，TAMAI N，YAMAZAKI I，et al.Fluorescence decays and spectral properties of rhodamine B in submono，mono，and multilayer systems［J］.Phys Chem，1986，90（21）：5094－5101.

［12］趙瑜，李隆弟.羅丹明和熒光素類染料的固體基質室溫燐光研究［J］.分析化學，1996，24（7）：745－749.

［13］宋秀麗.羅丹明類染料的固體表面室溫磷光分析法的研究：羅丹明類堿性染料用作磷光探針的嘗試［J］.山西師范大學學報：自然科學版，2000，14（4）：44－50.

Spectrum Characteristics of the Transient Fluorescence Spectra of Rhodamine B Stimulated by Pulsed LED

YE Ming－shu，TIAN Zhi－fu，HU Qing，ZHUANG Qi－ren
（College of Information Science and Engineering，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China）

In this paper，light－emitting diode（LED）source as excitation light pulses is used to study the transient spectra characteristics of rhodamine B.Excitation light source with three central wavelengths are 406nm，464nm and 528nm super bright purple，blue and green LED.Experimental results show that the fluorescence intensities are very different with the different excitation light color（wavelength），pulse duration and different concentration of the rhodamine B.In the same concentration，if the excitation duration（pulse width）is less than 10ms，only green fluorescent excitation can produce strong fluorescence，purple and blue light can not produce fluorescence；if the pulse width is greater than 20ms，the purple and blue can excite fluorescence but the intensity of excitation is much smaller than that of the green，and the fluorescence of blue is weakest.Using a suitable pulse width of purple，blue and green LED as the excitation source，the characteristics of the fluorescence spectra of rhodamine B can be obtained.

light emitting diode；rhodamine B；fluorescence spectra；pulse duration

黃曉楠 英文審校：吳逢鐵）

TN 29

A

1000－5013（2011）06－0623－05

2010－11－22

莊其仁（1960－），男，教授，主要從事光檢測技術的研究.E－mail：qrzhuang＠hqu.edu.cn.

福建省自然科學基金資助項目（A0710012）