陰離子聚電解質誘導硫代黃素T激基締合物的形成因素分析

唐琪，孫向英，李芳

（華僑大學 材料科學與工程學院，福建 泉州 362021）

陰離子聚電解質誘導硫代黃素T激基締合物的形成因素分析

唐琪，孫向英，李芳

（華僑大學 材料科學與工程學院，福建 泉州 362021）

研究在水溶液中陰離子聚電解質聚乙烯磺酸鈉（PVS）誘導陽離子型染料硫代黃素T（ThT）激基締合物的形成，考察在PVS存在下，ThT在水溶液中形成激基締合物的影響因素.通過光譜實驗及量化理論計算方法，比較ThT與PVS，PSS和PAA聚電解質之間的相互作用.結果表明：溶液pH值、溶劑和電解質的濃度對ThT激基締合物的形成均有顯著的影響；PSS，PVS可誘導ThT形成激基締合物，而PAA則無法誘導形成締合物；通過靜電吸引作用，PVS可以增加ThT的局部濃度，從而顯著地促進ThT激基締合物的形成.

硫代黃素T；激基締合物；熒光分析；聚電解質；量子化學

O 631.3；O 657.3

A

激基締合物［1-2］是指一個處于基態的熒光團和另一個處于激發態且具有同樣結構的熒光團之間發生相互作用形成的復合物 .在大多數情況下，可以觀測到單體和激基締合物的雙重熒光發射峰.激基締合物特有的發光特征可用作探針，在一些科學研究中已經獲得應用［3-5］.由于激基締合物的形成或破壞所引起的光譜行為變化是其作為探針應用的重要依據，所以研究激基締合物形成的基本條件和有關的熱力學數據，對其充分發揮探針的作用是十分重要的.聚電解質［6-11］是指主鏈或側鏈帶有可電離基團的高分子，在水溶液或強極性溶劑中可電離為聚離子和反離子，由于分子鏈上電離基團之間強的長程靜電相互作用，導致其有許多與中性高分子不同的特性.硫代黃素T（ThT）是一種陽離子熒光試劑，多用于檢測DNA和淀粉質體［12-14］.本文研究水溶液中聚陰離子電解質聚乙烯磺酸鈉（PVS）誘導陽離子型染料硫代黃素T激基締合物的形成，并考察PVS存在下，ThT在水溶液中形成激基締合物的影響因素.

1 實驗部分

1.1 試劑

硫代黃素T（ThT，比利時Acros公司），聚苯乙烯磺酸鈉（PSS，比利時Acros公司）；聚乙烯磺酸鈉（PVS，北京百靈威化學技術有限公司），聚丙烯酸（PAA，北京百靈威化學技術有限公司）；實驗用水為Milli－Q基礎型（美國Millipore公司）純化水系統提供的二次水.

1.2 儀器

Cary Eclipse型熒光分光光度計（美國Varian公司）；UV－2102PC型紫外可見光分光光度計（美國Unico公司）.

2 結果與討論

2.1 硫代黃素T濃度對其熒光光譜的影響

取一系列10mL的比色管，各加入1.00mL的10.0mmol·L－1的硫代黃素T 溶液和不同體積的0.10mg·L－1聚陰離子電解質（PVS，PSS和PAA），定容到10mL.固定熒光激發波長為335nm，狹縫為5.0nm／10nm，分別掃描ThT溶液在熒光池中的熒光光譜，如圖1所示.由圖1可見：硫代黃素T熒光強度（I）隨硫代黃素T濃度的變大先增大后減小，在0.100mmol·L－1時熒光強度達到最大.ThT熒光光譜隨著自身濃度的增大發生紅移，形成二聚體，但是始終沒有激基締合物的熒光峰出現.

不同濃度硫代黃素T的紫外可見吸收光譜曲線，如圖2所示 .圖2中：D為光密度 .從圖2可知：低濃度時，ThT主要以單體形式存在，在412nm處有吸收峰；隨著ThT濃度的增大，在255nm處出現明顯的吸收峰，該峰可能歸屬于硫代黃素T二聚體的形成.412nm處的特征吸收峰強度隨著ThT溶液濃度的增大而增強.

圖1 不同濃度ThT水溶液的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of ThT aqueous solution with different concentration

圖2 不同濃度ThT水溶液的紫外可見吸收光譜 Fig.2 Ultraviolet－visible absorption spectra of ThT aqueous solution with different concentration

2.2 PVS誘導ThT激基締合物的形成

在1.00mmol·L－1的ThT各溶液中加入不同濃度的聚乙烯磺酸鈉（PVS）溶液，穩定后測定溶液的熒光光譜，如圖3所示.從圖3可知：當ThT水溶液沒有PVS時，ThT主要以二聚體形式存在，熒光發射峰λem＝484nm；加入少量PVS引起二聚體熒光強度降低，同時在長波長方向出現一個新的相對較寬的激基締合物的熒光發射峰（λem＝556nm）.此外，隨著PVS濃度的增加，484nm處的二聚體熒光峰強度逐漸減弱后不變，556nm處的激基締合物熒光峰強度逐漸增強.

聚乙烯磺酸鈉（PVS）在誘導不同濃度的ThT時形成激基締合物的情況不相同 .在0.100mmol·L－1的ThT各溶液中加入聚乙烯磺酸鈉溶液形成熒光強度較弱的激基締合物，而1.00mmol·L－1的ThT與PVS能形成熒光強度較強的激基締合物 .因此，以1.00 mmol·L－1的ThT與PVS作用形成的激基締合物為例，研究PVS誘導ThT形成激基締合物的影響因素.

2.3 PVS誘導ThT形成激基締合物的影響因素

2.3.1 溶液pH值 ThT分子是通過靜電吸引作用局部濃縮在PVS大分子周圍形成激基締合物的，所以硫代黃素T分子是否質子化應該是形成激基締合物的一個關鍵條件.為了證明它們之間的靜電吸引作用對形成激基締合物的重要性，研究了溶液pH值對ThT分子形成激基締合物的影響.當溶液呈酸性時，ThT分子易質子化帶正電荷 .在0.03g·L－1PVS和1.00mmol·L－1ThT的混合溶液中，不同pH值的ThT水溶液的熒光光譜，如圖4所示.

圖3 PVS存在下ThT水溶液的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of ThT aqueous solution at various concentration of PVS

從圖4可以看出：ThT為酸性和中性條件下，其在484nm處出現二聚體峰，并且在長波方向556 nm處也有一個無精細結構的激基締合物的熒光峰出現；當ThT分子在pH值為12.4的堿性條件時，僅在430nm處出現單體的熒光峰 .這是因為堿性條件下，ThT分子沒有質子化，不能通過靜電吸引作用聚集在PVS大分子周圍，從而不利于硫代黃素T的激發態分子和基態分子相互作用形成激基締合物并產生熒光.當1.00mmol·L－1的ThT為酸性和中性時，其在484nm處有一個二聚體峰，但在強堿條件下只在430nm處出現單體的熒光峰.

2.3.2 溶劑性質 分別配制了1.00mmol·L－1ThT的水、乙醇、丙酮、乙腈、二甲亞砜溶液，再加入0.03g·L－1的聚電解質PVS，測定其熒光光譜，如圖5所示.從圖5可知：在ThT的水溶液中有二聚體和激基締合物的雙重熒光峰出現，而在乙醇、丙酮、乙腈、二甲亞砜溶液中，只有二聚體的熒光峰.這是因為聚電解質的溶液性質與所用溶劑性質關系很大.

在離子化溶劑中，聚電解質［15］容易發生離解，在溶液中形成高分子離子和小分子反離子，表現出電解質的性質，它不僅和普通高分子的溶液性質不同，而且還表現出低分子電解質沒有的特殊行為 .但是若采用非離子化溶劑，則其溶液性質與非電解質相似.因此，聚電解質PVS在水中容易離解成高分子陰離子，能夠靜電吸引帶正電荷的ThT分子，促使ThT在高分子周圍的局部濃度增大，有利于ThT的激發態分子和基態分子相互作用形成激基締合物并產生熒光；而聚電解質PVS在乙醇、丙酮、乙腈、二甲亞砜溶液中卻不容易離解，很難與ThT鍵合使其形成激基締合物.

2.3.3 電解質 由于ThT激基締合物的形成是由于正負離子間的靜電作用引起的，因此加入電解質肯定會影響ThT與聚電解質分子PVS之間的鍵合.在0.03g·L－1PVS和1.00mmol·L－1ThT的混合溶液中，電解質氯化鈉對ThT二聚體及其激基締合物熒光光譜的影響，如圖6所示.

從圖6可知：逐漸加入氯化鈉會導致激基締合物熒光強度逐漸降低，而二聚體熒光逐漸增強；當NaCl濃度達到0.100mol·L－1時，激基締合物熒光峰基本上消失，只能觀察到二聚體的熒光峰；再繼續增加鹽的濃度，IE／IM變化不大.這是因為電解質氯化鈉可以“屏蔽”PVS的負離子和ThT正離子之間的靜電吸引作用［16］，從而在PVS大分子周圍不再出現ThT分子的“局部濃縮”現象，因而不再形成激基締合物.

圖4 不同pH值的ThT水溶液的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of ThT aqueous solution at different pH value

圖5 ThT在不同溶劑中的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of ThT in different solvents

圖6 NaCl對ThT水溶液熒光光譜的影響 Fig.6 Effects of NaCl to fluorescence spectra of ThT aqueous solution

2.4 ThT與不同聚陰離子的作用比較

2.4.1 熒光光譜和紫外可見吸收光譜分析 在0.100mmol·L－1的ThT溶液中，加入不同濃度的聚乙烯磺酸鈉（PVS）、聚苯乙烯磺酸鈉（PSS）和聚丙烯酸（PAA）溶液，穩定后測定溶液的熒光光譜，結果如圖7所示.從圖7可知：當ThT水溶液沒有聚陰離子電解質時，只有單體的熒光峰（λem＝463nm），而當加入聚陰離子電解質PVS和PSS溶液后，單體熒光強度降低，同時在長波長方向出現一個新的寬而無精細結構的激基締合物的熒光峰.隨著PSS加入量的增加，463nm處的熒光峰逐漸減弱，556nm處的熒光峰逐漸增強.當PSS濃度達到一定值時，556nm處的熒光最強.

從圖7（a），（b）可知：增大聚陰離子的濃度，PSS誘導ThT形成的激基締合物的熒光強度超過了單體峰的強度，單體峰基本消失，而PVS誘導的締合物的熒光強度無法超過單體峰的強度，單體峰仍然存在.

從圖7（c）可知：當ThT水溶液沒有PAA時，只有單體的熒光峰時，加入少量PAA引起單體熒光強度降低，并沒有激基締合物的熒光峰出現.隨著PAA加入量的增加，463nm處的熒光峰逐漸減弱.當PAA濃度達到一定值時，繼續增大PAA濃度，在463nm處單體熒光強度不再變化.實驗表明，PAA不能誘導ThT激基締合物形成.

圖7 不同聚陰離子電解質誘導ThT水溶液的熒光光譜Fig.7 Effects of NaCl to fluorescence spectra of ThT aqueous solution

在0.025g·L－1聚陰離子電解質和無聚陰離子電解質存在條件下，0.100mmol·L－1ThT水溶液的紫外可見吸收光譜，如圖8所示.由圖8（a）可見：在沒加入PVS之前，ThT溶液在412，255nm處存在很明顯的吸收峰，而加入PVS之后，255nm處吸收峰強度明顯減弱，412nm吸收峰位有所藍移，吸光強度變化不大.

前面曾推測255nm處吸收峰可能歸屬為硫代黃素T二聚體的形成 .由圖8（a）表明：加入PVS后不利于硫代黃素T二聚體的形成，才導致255nm處吸收峰強度明顯減弱，此時硫代黃素T在溶液中主要以激基締合物的形式和少量的單體形式存在.

和圖8（a）相似，圖8（b）中255nm 處的吸收更小 .這可能是因為PSS比PVS對陽離子染料硫代黃素T的作用力更強，更有利于締合物的生成.

圖8 不同聚陰離子電解質誘導ThT水溶液的紫外吸收光譜Fig.8 UV absorption spectra of ThT aqueous solution at various concentration of anionic

圖8（c）在加入PAA前后，ThT溶液在412，255 nm處存在很明顯的吸收峰，而且加入前后的強度相差不大，幾乎沒有變化 .這主要是因為PAA的加入沒有誘導ThT生成激基締合物，溶液中ThT仍以單體和二聚體的形態存在，與熒光光譜分析的結果相吻合.

2.4.2 理論計算法分析 量子化學可以在分子、電子水平上對體系進行精細的理論研究，是其他理論研究方法所難以替代的.采用高斯軟件中G09，B3lyp機組采用的是6－311＋＋g＊＊并進行BSSE校正，計算ThT與PSS，PVS及PAA等3個陰離子聚合物的鏈接之間的相互作用.選取ThT的最穩定構象，分別與1個功能單體分子的鏈接最穩定構象形成可能的復合物，優化得到各復合物的穩定構型，找出最穩定構型；然后，根據下式計算復合物的結合能，即

最后，根據結合能的大小，判斷復合物的穩定性.由各組分的穩定構象，計算得到各復合物的結合能，如表1所示.表1中：ΔECP（R）為經零點能校正的結合能.

從表1可知：ThT與PSS，PVS的結合能較之與PAA的更負，即PSS，PVS與ThT的作用力比PAA與ThT的作用力強.所以，PSS，PVS可誘導ThT形成激基締合物，而PAA則無法誘導形成締合物.ThT與PSS的結合能比ThT與PVS的結合能更負，故ThT與PSS作用力更強 .由此可知，PSS誘導ThT形成激基締合物的能力更強.量子化學理論計算法所得結果與光譜法實驗結果一致.

表1 各穩定構象體系的結合能Tab.1 Energies of various stable conformation systems and their binding energies kJ·mol－1

3 結束語

研究了陰離子聚電解質聚乙烯磺酸鈉（PVS）誘導陽離子型染料硫代黃素T（ThT）形成激基締合物，并考察了PVS存在下，ThT在水溶液中所形成激基締合物的各種影響因素.結果表明：ThT依靠自身濃度的增大是很難形成激基締合物的，但是在PVS存在下卻可以形成激基締合物，而且溶液pH值、溶劑和電解質濃度對ThT激基締合物的形成均有顯著的影響.

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Formation of Thioflavin T Excimer Induced by Anionic Polyelectrolyte and Its Influencing Factors

TANG Qi，SUN Xiang－ying，LI Fang
（College of Material Science and Engineering，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China）

In this paper，we have studied the formation of thioflavin T（ThT）excimer induced by anionic polyelectrolyte sodium polyethylene sulfonate（PVS）.The influencing factors of the formed Thioflavin T excimer in the presence of PVS were investigated.Furthermore，we have made a study on the interaction of ThT with three kinds of anionic polyelectrolyte（PVS，PSS and PAA）by spectroscopic techniques as well as computational approach of quantum chemistry computational approach of quantum chemistry.Results showed that pH of solution，concentration of solvent and electrolyte affect the formation of ThT excimer significantly.PSS and PVS can promote the formation of excimer，but PAA can not PVS can increase partial concentration of ThT by electrostatic attraction process，markedly promoting the formation of excimer.

thioflavin T；excimer；fluorescence analysis；polyelectrolyte；quantum chemistry

錢筠 英文審校：陳國華）

1000－5013（2011）06－0646－06

2011－05－11

孫向英（1965－），女，教授，主要從事光化學和電化學傳感分析的研究.E－mail：sunxy＠hqu.edu.cn.

國家自然科學基金資助項目（20955001；20575023）；福建省自然科學基金資助項目（D0810016）；教育部留學回國人員科研啟動基金資助項目（2008年度）