猴頭菌固體發酵基質的抗氧化活性成分研究

張新超 郭麗瓊 林俊芳 雷韻祺

（1.華南農業大學食品學院生物工程系，廣東 廣州 510640；2.華南農業大學生物質能研究所，廣東 廣州 510640；3.廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山 528415）

猴頭菌固體發酵基質的抗氧化活性成分研究

張新超1，3郭麗瓊1，2林俊芳1，2雷韻祺1

（1.華南農業大學食品學院生物工程系，廣東 廣州 510640；2.華南農業大學生物質能研究所，廣東 廣州 510640；3.廣東珠江橋生物科技股份有限公司，廣東 中山 528415）

選用燕麥、大豆、玉米、麩皮、大米、蕎麥6種培養基質，對猴頭菌進行固體發酵及抗氧化活性研究。結果表明：猴頭菌最佳抗氧化發酵基質為蕎麥大豆培養基（蕎麥79.13%，大豆20.87%），最佳發酵條件為溫度30℃，培養料粒度40目，培養基含水量70%，初始pH值4，接種量4.5%，發酵時間12d。猴頭菌蕎麥發酵基質抗氧化活性成分種類豐富，含量高，其中總黃酮物質87.13μg／g，總三萜2.58mg／g，多酚4.51mg／g，還原糖 21.53mg／g，花色苷68.96μg／g，VC14.07mg／g，VE205.85μg／g，GSH 853.65mg／g，SOD 酶活性293.57U／g。

猴頭菌；固體發酵；發酵基質；抗氧化成分

人類和動物持續暴露在活性氧與促氧化劑中，很容易引起機體組織發生氧化應激，導致機體代謝性功能的紊亂以及一系列的慢性疾病，如癌癥、血脂異常等［1］。食用一些富含具有抗氧化生物活性物質的功能性食品，可以延緩或預防機體組織氧化應激損傷。食藥用菌以其較強的生理功能和較小的毒副作用的特性，被越來越廣泛采用。

猴頭菌是著名的食用、藥用真菌，素稱“蘑菇之王”，它與熊掌、燕窩、魚翅并列為四大名菜，自古以來被譽為“山珍”。猴頭菌富含多種有益菌多糖和人體必需氨基酸以及微量元素（如Fe、Cu、Zn、Se等），此外還含有多種抗氧化成分［2］。中國已經廣泛用于醫治消化不良、胃潰瘍、食道癌、胃癌、十二指腸潰瘍、肛門癌等消化系統的疾病與腫瘤的治療［3］。

目前對猴頭菌的抗氧化功能研究僅僅停留在其子實體或菌絲體成分分析階段。本試驗選用燕麥、大豆、玉米、麩皮、大米、蕎麥6種培養基對猴頭菌進行固體發酵研究，分析其發酵基質的抗氧化成分，為開發猴頭菌功能性菌質食品提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

猴頭菌：購于山東壽光食用菌研究所；

燕麥、大豆：市售；

2，2－聯氮－二（3－乙基－苯并噻唑－6－磺酸）（ABTS）、VE標準品（含量≥96%，以α－生育酚計）、蘆丁標品、齊墩果酸標品、抗壞血酸標準品（L－抗壞血酸）：Sigma Aldrich公司；

還原型谷胱甘肽 （GSH）試劑盒：南京建成生物工程研究所；

其余試劑：均為市售分析純。

1.2 培養基與培養方法

PDA培養基：馬鈴薯（去皮）200g／L、葡萄糖20g／L、磷酸氫二鉀3g／L、硫酸鎂1.5g／L、葡萄糖 20g／L、瓊脂20g／L，蒸餾水定容，高壓滅菌后備用。

猴頭菌母種經活化后接種于PDA平板并置于30℃培養7d，然后在無菌條件下轉接入發酵培養基（玻璃組培瓶，高10cm，直徑6.5cm）中，30℃培養。

1.3 試驗方法

1.3.1 最優抗氧化培養基的確定 以大米、燕麥、大豆、麩皮、玉米、蕎麥為基本培養料，按照猴頭菌所需碳氮比（27∶1）。運用design expert 7.0軟件選用 mixture design的單型格子設計，以生長速度和總自由基清除率為響應值確定最佳抗氧化培養基。

1.3.2 總自由基清除率測定

（1）浸提液的提取：參照文獻［4］的方法并作改進。將發酵后的固體菌質60℃烘干，粉碎，過60目篩，精確稱取1.000g，加入95%乙醇10mL，25℃以200r／min搖床旋轉下萃取24h，離心（6 000g，5min），上清液即為醇提液。剩余殘渣，加10mL水，25℃下以200r／min搖床旋轉萃取24h，離心（6 000g，5min），取上清液即為水提液。

（2）自由基清除率測定：采用 ABTS法［5］。

1.3.3 最佳發酵條件的確定 在培養料未分粒度，培養料含水量為60%，接種量為1.5%，發酵溫度為30℃，培養基初始pH值自然的基礎上，對發酵溫度（20，25，28，30，32，35℃）、培養料粒度（10，20，30，40，60目）、培養基含水量（50%，60%，65%，70%）、培養基初始pH 值（4，5，6，7，8，9）、接種量（1.5%，3%，4.5%，6%，7.5%）進行優化，確定最佳的發酵條件。

1.3.4 抗氧化成分測定 發酵結束后，將猴頭菌發酵基質置于烘箱60℃下烘干，粉碎過60目篩，備用。未發酵基質滅菌（121℃，30min）后置于烘箱60℃下烘干，粉碎過60目篩，備用。

（1）總黃酮的測定：參照文獻［6］的方法進行。以蘆丁為標準品，標準曲線回歸方程為y＝5.112 5x＋0.006 6，R2＝0.999 6。

（2）總多酚的測定：參照文獻［7］的方法進行。以沒食子酸為標準品，標準曲線回歸方程為y＝0.025 1x＋0.045 4，R2＝0.996 2。

（3）總三萜的測定：總三萜的提取參考文獻［8］的方法并有所改進。稱取（0.250 0±0.000 2）g，加入三氯甲烷100mL回流提取1h，冷卻，于45℃減壓回收至干，加15mL飽和NaHCO3溶液洗至分液漏斗，再用6mol／L的HCl調節pH值至3～4，后用氯仿（CHCl3與NaHCO3體積比為1∶2）萃取，收取氯仿層（下層），減壓蒸干氯仿，加甲醇定容至10mL的容量瓶刻度。

總三萜的測定參照文獻［9］的方法進行。以齊墩果酸為標準品，標準曲線回歸方程為y＝4.822x－0.006 6，R2＝0.992 8。

（4）還原糖的測定：采用 DNS法［10，11］。以葡萄糖為標準品，標準曲線回歸方程為y＝0.533 3x－0.009 6，R2＝0.998。

（5）VC的測定：參照文獻［12］的方法進行。以L－抗壞血酸為標準品，標準曲線回歸方程為y＝0.105 2x－0.110 7，R2＝0.999。

（6）VE的測定：參照文獻［13］的方法進行。以α－生育酚為標準品，標準曲線回歸方程為y＝2.900 5x－0.000 7，R2＝0.999 2。

（7）花色苷的測定：參照文獻［14］的方法進行。

（8）內源性抗氧化物質（GSH、SOD）的測定：谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）樣品液的提取參照Chung等的方法［15］進行。還原型谷胱甘肽的測定嚴格按照試劑盒說明書操作，GSH含量的單位為 mg／g；SOD的測定參照Beyer等的方法［16］進行。

1.3.5 數據統計 樣品測定采用6個重復。試驗結果用SPSS 17.0軟件進行統計分析，以平均值±標準差 （x±S）表示，運用Excel 2003軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 最優培養基配方的確定

猴頭菌在不同培養基質的生長速度及發酵后基質的總自由基清除率結果見表1。由表1可知，配方5生長速度與配方1、2、3、4、6、7差異均不顯著（P＜0.05），與其他配方差異顯著（P＜0.05）；總自由基清除率與其他配方差異均顯著（P＜0.05），最終選定配方5為最優抗氧化培養基即蕎麥大豆培養基。培養基組成成分為：蕎麥79.13%，大豆20.87%。

2.2 最佳發酵條件的確定

2.2.1 溫度對發酵的影響 猴頭菌在不同發酵溫度下發酵后基質的自由基清除率和生長速度見圖1。

由圖1可知，猴頭菌30℃生長速度與其他溫度差異均顯著（P＜0.05）；自由基清除率與其他溫度差異均顯著（P＜0.05），最終選定溫度30℃為猴頭菌最優發酵溫度。

2.2.2 培養料粒度對發酵的影響 猴頭菌在不同培養料粒度下發酵后基質的自由基清除率和生長速度見圖2。

由圖2可知，猴頭菌40目，生長速度與20，30目呈現不顯著差異（P＜0.05），與10，60目差異顯著（P＜0.05）；自由基清除率與其他均呈顯著差異（P＜0.05）。最終選定培養料粒度40目為猴頭菌最優培養料粒度。

表1 培養基質對猴頭菌生長速度及總自由基清除率的影響 Table 1 Influence of the mixture composition on the growth rate and the radical scavenging activity during solid cultivation of Hericium erinaceum

圖1 發酵溫度對猴頭菌發酵后基質的自由基清除率和生長速度的影響Figure 1 Influence of fermentation temperature on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

圖2 培養料粒度對猴頭菌發酵后基質的自由基清除率和生長速度的影響Figure 2 Influence of material grain size on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

2.2.3 初始pH值對發酵的影響 猴頭菌在不同初始pH值下發酵后基質的自由基清除率和生長速度結果見圖3。由圖3可知，猴頭菌pH＝5，生長速度與其他均呈現不顯著差異（P＜0.05）；自由基清除率與pH＝6、pH＝7、pH＝9均呈不顯著差異（P＜0.05），與pH＝4、pH＝8差異顯著（P＜0.05）。但由于pH＝5時猴頭菌發酵后基質的自由基清除率最高，故最終選定初始pH＝5為猴頭菌最優初始pH值。

圖3 初始pH值對猴頭菌發酵后基質的自由基清除率和生長速度的影響Figure 3 Influence of initial pH on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

2.2.4 培養基含水量對發酵的影響 猴頭菌在不同培養基含水量下發酵后基質的自由基清除率和生長速度見圖4。

由圖4可知，猴頭菌培養基含水量60%，生長速度與80%呈不顯著差異，與其他差異均顯著（P＜0.05）；自由基清除率與其他差異均顯著（P＜0.05）。最終選定60%為猴頭菌最適培養基含水量。

2.2.5 接種量對發酵的影響 猴頭菌在不同接種量下發酵后基質的自由基清除率和生長速度見圖5。

圖4 培養基含水量對猴頭菌發酵后基質的自由基清除率和生長速度的影響Figure 4 Influence of culture medium moisture on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

圖5 接種量對猴頭菌發酵后基質的自由基清除率和生長速度的影響Figure 5 Influence of inoculation on the radical scavenging activity and the average growth speed during solid cultivation of Hericium erinaceum

由圖5可知，猴頭菌接種量7.5%，生長速度與3%、4.5%、6%呈不顯著差異，與1.5%差異顯著（P＜0.05）；自由基清除率與其他差異均不顯著（P＜0.05）。但由于接種量為7.5%時猴頭發酵后基質的總自由基清除率最高，最終選定7.5%為猴頭菌最適接種量。

2.3 培養時間的確定

發酵時間對猴頭菌自由基清除率的結果見圖6。

圖6 發酵時間對猴頭菌基質自由基清除率的影響Figure 6 Influence of fermentation time on the radical scavenging activity during solid cultivation of Hericium erinaceum

由圖6可知，猴頭菌基質自由基清除率隨著發酵時間的增長發生顯著性變化（P＜0.05），其中在12d出現最大，14，16d未出現顯著性差異，但其他時間點出現顯著性差異（P＜0.05）。故選擇12d作為猴頭菌最佳培養時間。

2.4 猴頭菌基質抗氧化活性成分分析

猴頭菌發酵完全后，其基質的抗氧化活性成分測定結果見表2。由表2可知，猴頭菌發酵基質中抗氧化活性成分，與未發酵的基質相比，總黃酮含量及還原糖含量下降明顯，總三萜物質含量略有下降，花色苷及總多酚含量上升，VC略有下降，VE含量明顯上升，SOD酶活性提高，GSH含量上升為原來的4倍左右。

表2 猴頭菌發酵基質抗氧化活性成分分析Table 2 The antioxidant components analysis of full fermentation substrate of Hericium erinaceum

3 討論

本試驗在前期研究的基礎上，對猴頭菌在蕎麥大豆培養基固體發酵得到的發酵基質進行抗氧化成分分析，發酵前后各抗氧化成分含量變化明顯。總黃酮含量的下降可能是猴頭菌生長代謝中利用黃酮醇物質（包括花色素）與還原糖發生反應生成苷元含量降低造成，這與Gert等［17］報道相符。總三萜物質含量略有下降的原因可能是發酵過程中猴頭菌菌絲生長代謝過程中分解三萜皂苷，釋放苷元以合成其他新的糖苷物質，這與Shashi等［18］報道相符。總多酚含量的上升可能是猴頭菌生長過程中產生的酚類次生代謝產物聚合累積所致，這與Fulgencio等［19］報道基本相符。花色苷含量的升高可能是猴頭菌生長代謝過程中利用糖類和色素物質合成了花色苷，這與Jin等［20］報道相一致。還原糖的含量顯著降低與總黃酮含量的下降和花色苷含量的上升相吻合。維生素類物質中VC略有下降，VE含量明顯上升的原因為發酵過程中通過分解VC并利用其他物質產生新的VE。內源性抗氧化物質中SOD酶活性和GSH含量的提高是發酵過程中猴頭菌菌絲生長代謝過程自身產生的結果。本試驗結果表明，猴頭菌在蕎麥大豆基質發酵后，基質中抗氧化物質含量整體提高明顯，以猴頭菌固體發酵后基質中的抗氧化物質開發新型抗氧化食品切實可行，為進一步開發功能性菌質食品提供了參考。

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Analysis of antioxidant components of solid fermented substrates withHericium erin aceum

ZHANG Xin－chao1，3GUO Li－qiong1，2LIN Jun－fang1，2LEI Yun－qi1

（1.Department of Bioengineering，College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510640，China；2.Institute of Biomass Research，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510640，China；3.Guangdong Pearl River Bridge Bio－Tech CO.，LTD，Zhongshan，Guangdong528415，China）

Hericium erinaceumwas cultured on the medium including oat，wheat bran，soybeans，corn，rice and buckwheat with solid－state fermentation，and then was determined the best fermentation time and was analyzed antioxidant components of substrate.The results show that the best antioxidant fermentation substrate ofHericium erinaceumwas buckwheat and soybeans complex medium （79.13%buckwheat and 20.87%soy beans），the optimum fermentation temperature for 30℃，material grain size for 40mesh，medium moisture for 70%，initial pH for 4，inoculation for 4.5%，and the best fermentation time was 12d.The antioxidant components ofHericium erinaceumsubstrate with buckwheat were rich in varieties and high in contents，such as flavonoids 87.13μg／g，total triterpenoid 2.58mg／g，total polyphenols 4.51mg／g，reducing sugar 21.53mg／g，anthocyanins 68.96μg／g，VC14.07mg／g，VE205.85μg／g，GSH 853.65mg／g，SOD activity 293.57U／g.

Hericium erinaceum；solid fermentation；cultivation substrates；antioxidant components

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.011

國家自然科學基金（編號：31071837）；廣東省科技計劃（編號：2009B020201012）

張新超（1986－），男，華南農業大學在讀碩士研究生。E－mail：selvan.zhang＠gmail.com

林俊芳

2011－04－01