UPLC－MS/MS法測定乳制品中的氯霉素類藥物

任 佳 鄭小平 黃菲菲 陳景春 馬穎清 樓 飛

（農業部食品質量監督檢驗測試中心（上海），上海 200436）

UPLC－MS/MS法測定乳制品中的氯霉素類藥物

任 佳 鄭小平 黃菲菲 陳景春 馬穎清 樓 飛

（農業部食品質量監督檢驗測試中心（上海），上海 200436）

建立超高效液相色譜－串聯質譜（UPLC－MS/MS）法測定乳與乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測方法。樣品經乙腈及乙酸乙酯提取、正己烷脫脂、C18柱凈化后，通過超高效液相色譜－質譜聯用儀進行檢測，內標法定量。各標準溶液在0.1～10μg/L范圍內呈線性相關 （r＝0.999），不同基質樣品中添加回收率為75%～114%，檢出限為0.1μg/kg。結果表明，該方法是一種準確測定乳與乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測方法。

氯霉素；甲砜霉素；氟苯尼考；超高效液相色譜－串聯質譜；乳與乳制品

氯霉素類藥物是一種高效廣譜的抗生素，包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。氯霉素對人體具有毒副作用，能抑制造血機能，引發人體的粒細胞缺乏病、再生障礙性貧血和溶血性貧血［1］。因此，很多國家規定氯霉素的殘留限量標準為“零容許量”，即不得檢出。中國農業部235號公告規定鮮奶中不得檢出氯霉素，甲砜霉素殘留限量為50μg/kg。目前，針對水產品、蜂產品、動物組織等基質中氯霉素類藥物的檢測方法較多，主要有微生物法［2，3］、酶聯免疫法［4］、氣相色譜法［5，6］、液相色譜法［7］、氣相色譜－質譜聯用法［8，9］、液相色譜－質譜聯用法［10－12］等，但針對乳與乳制品中氯霉素類藥物的檢測方法較少。乳與乳制品如采用其他方法中較常使用的提取試劑乙酸乙酯直接提取，會發生嚴重的乳化現象。這是由于蛋白質與脂肪，尤其是脂肪具有乳化性，在進行劇烈震蕩提取過程中容易產生乳化現象。乳與乳制品的主要組成包括蛋白質、脂肪、糖類、維生素、無機鹽、水分等，這些樣品基質的存在不但干擾待測物的檢測，而且會污染儀器和降低設備使用壽命，需要重新選擇合理有效的提取試劑。UPLC－MS/MS具有快速，高靈敏度和高專一性等特點，不受化學噪聲的干擾。本試驗利用UPLC－MS/MS，旨在建立一種乳與乳制品中氯霉素類藥物的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

牛奶、奶粉、乳清粉：均為市售產品。

1.2 試劑

乙酸乙酯、乙腈：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

正己烷、甲醇：色譜純，西格瑪奧德里奇公司；

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考（標準物）：純度＞99%，德國Dr.Ehrenstorfer公司；

氘代氯霉素（標準物）：100μg/mL，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

混合標準溶液的配制：準確稱取適量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考標準物質，用甲醇配成100μg/mL的標準儲備溶液。準確吸取1mL標準儲備溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，此混合溶液中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考濃度為1.0μg/mL。

氘代氯霉素內標標準溶液配制：準確吸取100μL氘代氯霉素于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。

1.3 儀器與設備

超高效液相色譜－串聯質譜儀：Quattro Premie，美國沃特世公司；

氮吹儀：ANPEL DC12，上海安譜科學儀器有限公司；

SPE固相萃取柱：LC－C18，色譜科公司。

1.4 方法

1.4.1 樣品準備

（1）液態奶：準確稱取5g，置于15mL離心管中。

（2）奶粉、黃油、奶酪、乳清粉等乳制品：準確稱取2g，置于15mL離心管中，用5mL水溶解，必要時可加熱溶解。

1.4.2 樣品中氯霉素類藥物的提取 準確吸取氘代氯霉素內標標準溶液50μL于裝有樣品的15mL離心管中，加入5mL乙腈，渦旋振蕩提取1min，以4 000r/min離心5min，上清液轉移至100mL燒杯，重復提取2次，合并上清液；加入10mL乙酸乙酯以及5g氯化鈉，渦旋振蕩提取1min，4 000r/min離心5min，棄下層水，收集的乙腈－乙酸乙酯混合溶液在50℃左右使用氮吹儀吹干；吹干后的提取物分別用4mL水、4mL正己烷溶解后轉移至15mL離心管，渦旋振蕩1min，以4 000r/min離心5min，棄上清液，用4mL正己烷重復提取1次，棄上清液，下層水溶液備用。

1.4.3 C18柱凈化處理 依次用3mL甲醇、3mL水活化，取備用液過柱，棄去流出液，用3mL水淋洗，減壓抽干，用3mL甲醇洗脫，收集洗脫液于離心管中，置于氮吹儀上50℃ 吹至近干，用1mL甲醇－水混合溶液（30＋70）溶解，經0.22μm濾膜過濾，試液供測定。

1.5 色譜和質譜條件

1.5.1 UPLC條件 色譜柱：C18色譜柱，粒徑1.7μm，50mm ×2.1mm；柱溫：40℃；進樣量：10μL；流動相：甲醇＋水 （30＋70）；流速：0.20mL/min。

1.5.2 串聯質譜條件 離子源：電噴霧負離子源；檢測方式：多反應檢測（MRM）；毛細管電壓：2.5kV；離子源溫度：110℃；脫溶劑氣及錐孔氣：氮氣，流量分別為700，50L/h；碰撞氣：氬氣；定性離子對、定量離子對及對應的保留時間、錐孔電壓和碰撞能量見表1。

2 結果與分析

2.1 線性關系

將混合標準溶液稀釋得到濃度為0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μg/L的標準系列。在規定的色譜條件下進行測定，得到的線性方程見表2。由表2可知，在0.1～10μg/mL范圍之內氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考濃度與色譜峰面積響應值之間存在著良好的線性關系。標準溶液的多反應監測（MRM）圖譜見圖1。表明濃度為0.1μg/L時各標準物質響應值良好。

表1 各標準物質的多反應監測的參考值Table 1 The reference value in multiple reaction monitoring of each standard material

表2 標準溶液回歸方程及相關系數Table 2 Regression equation and the correlation coefficient of the standard solution

圖1 標準溶液MRM色譜圖Figure 1 MRM chromatogram of standard solution

2.2 準確度與精密度試驗

選取牛奶、奶粉、乳清粉三類典型樣品，進行氯霉素類抗生素添加回收試驗，每個水平進行6次平行測定，測定數據見表3。牛奶空白樣品及加標回收樣品MRM色譜圖見圖2和圖3。

表3 不同樣品中平均加標回收率和相對標準偏差（RSD）試驗結果Table 3 The recovery and RSDof different samples（n＝6）

圖2 牛奶空白樣品MRM色譜圖Figure 2 MRM chromatogram of milk blank sample

圖3 牛奶加標（0.1μg/kg）樣品 MRM 色譜圖Figure 3 MRM chromatogram of milk standard sample

由表3可知，按已確定的樣品提取條件和儀器條件測定添加回收量，其平均回收率達到75%～114%，相對標準偏差＜10%，說明該方法對不同樣品、不同含量的氯霉素類藥物的測定均有較好的準確度和精密度。由圖2、3可知，添加濃度為0.1μg/kg時各標準物質響應值良好，證明該方法靈敏度高，能滿足檢測條件。

2.3 檢出限

根據限量檢測要求，對牛奶、奶粉兩種典型樣品進行氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考加標回收重復試驗，見表3。當添加濃度為0.1μg/kg時，信噪比S/N＝6.7＞3，試驗結果表明，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考檢出限為0.1μg/kg。

3 結論

本試驗建立了超高效液相色譜－串聯質譜法測定乳與乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測方法。采用乙腈、乙酸乙酯提取樣品中的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，正己烷去脂，C18柱凈化后通過液質聯用儀進行檢測，內標法定量各標準溶液在0.1～10μg/L范圍內呈線性相關 （r＝0.999），區不同基質樣品中添加回收率為75%～114%。與其他的檢測方法相比，本方法在前處理上，易于操作，可完全消除乳化影響；適用范圍廣，可適用于乳與乳制品（包括液態奶、乳粉、乳清粉、奶酪等）中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢測；靈敏度高，檢出限可達到0.1μg/kg，完全滿足乳制品進出口檢測的需要。表明本試驗提出的方法能準確測定乳與乳制品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的含量。

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2 焦彥朝，何家香，梅先芝.微生物檢定法測定鯉魚肌肉組織殘留氯霉素［J］.中國飼料，2000（5）：22～24.

3 宋杰，宋燕青，王勇鑫，等.微生物法在檢測牛奶中氯霉素殘留的應用［J］.河北師范大學學報，2005，29（1）：85～87.

4 Scortichini G，Annunziata L，Haouet M N，et al.ELISA qualitative screening of chloramphenicol in muscle，eggs，honey and milk：method validation according to the Commission Decision 2002/657/EC criteria［J］.Analytica Chimica Acta.，2005，535：43～48.

5 吳明媛，楊姝麗，黎小正，等.毛細管電子捕獲氣相色譜法同時測定水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留［J］.廣西農業科學，2009，40（5）：567～570.

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7 戴華，王美玲，李擁軍，等.飼料中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素含量的 HPLC 測定方法［J］.光譜實驗室，2006，23（6）：1 209～1 212.

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9 中華人民共和國農業部.農業部781號公告－10－2006蜂蜜中氯霉素殘留量的測定 氣相色譜－質譜法（負化學源）［S］.北京：中國農業出版社，2006.

10 劉艷琴，王浩，殷曉燕，等.高效液相色譜－電噴霧離子阱質譜測定乳品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素殘留的研究［J］.食品科學，2008，29（4）：344～346.

11 蔡欣欣，張秀堯.超高效液相色譜三重四極桿質譜法快速測定動物源食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留［J］.中國衛生檢驗雜志，2009，19（2）：258～260.

12 中國標準化管理委員會.GB/T 20756——2006可食動物肌肉、肝臟和水產品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考殘留量的測定 液相色譜－串聯質譜法［S］.北京：中國標準出版社，2006.

Determination of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol residues in milk and dairy products by UPLC－MS/MS

REN Jia ZHENG Xiao－ping HUANG Fei－fei CHEN Jing－chun MA Ying－qingLOU Fei

（Food Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture，Shanghai200436，China）

A method of determination of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in milk and dairy products by Ultra Performance Liquid Chromatography－Tandem Mass Spectrometry （UPLC－MS/MS）was developed .Samples were extracted with acetonitrile and ethyl acetate，and defatted with hexane.Through clean－up with C18column，Samples were detected by UPLC－MS/ MS.The method had a good linear relativity（r：0.999）between 0.1～10μg/L.Recovery rates in different substrate samples range from 75%to 114%，with LOD of 0.1μg/kg.The method was accurate and suitable for the quantification and confirmation of chloramphenicol，thiamphenicol and florfenicol in milk and dairy products.

chloramphenicol；thiamphenicol；florfenicol；UPLC－ MS/MS；milk and dairy products

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.04.020

上海市技術性貿易措施應對專項（編號：2008TBT012）

任佳（1984－），女，農業部食品質量監督檢驗測試中心工程師，碩士。E－mail：renjia1102＠hotmail.com

鄭小平

2011－03－30