P24在HIV感染者和艾滋病患者檢測中的應用

　　關鍵詞：艾滋?。籔24抗原；窗口期；免疫復合物
　　中圖分類號：R512.91
　　文獻標識碼：A
　　文章編號：1007-2349（2011）10-0028-03
　　
　　獲得性免疫缺陷綜合征（Acquired ImmunoDeficiency Syndrome）簡稱艾滋病（AIDS），是由人類免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染機體所引起的一種嚴重的傳染性疾病。目前該疾病已從在高危人群傳播逐步轉化為在一般人群傳播，因此艾滋病的預防與控制成為醫務和研究工作的重要部分。對HIV感染的檢測方法包括抗體檢測、P24抗原檢測、核酸檢測以及CD4+T淋巴細胞水平檢測等［1］。機體感染HIV后，P24抗原是較早能從血清中檢出的病原學標志，感染后約2～3周即可檢出，1～2個月左右進入抗原高峰，然后隨著機體抗體的逐漸產生，由于抗體的中和作用，形成抗原抗體復合物，而游離性抗原很少，甚至會低于監測水平，機體進入無癥狀感染期。疾病后期，隨著病毒的復制增強，免疫系統逐漸破壞，P24抗原水平會再次提高作為HIV活動性感染的標志。而HIV抗體的檢測存在一個窗口期，一般平均為2～3個月，但95%以上HIV-1感染者產生抗體的時間是在感染后6個月以內［2］。P24抗原在血清抗體陽轉前2 d～18 d即可檢測到，因此HIV-1 P24抗原檢測可作為HIV抗體檢測窗口期的輔助診斷［3］，也可檢測疾病進展、進行藥物療效評估等。
　　1 P24的組成特點
　　P24抗原是HIV的主要結構蛋白，在病毒的包裝和成熟過程中起重要作用，缺失P24病毒將無法正常組裝。HIV在病毒“大家族”中的定位是逆轉錄病毒科慢病毒屬中的人類免疫缺陷病毒組，為球形顆粒，直徑約100~120 nm。典型的HIV-1由核心和包膜兩部分組成，核心包括兩條正股RNA鏈、核心結構蛋白和病毒復制所必須的酶類，病毒復制所必須的酶類包括逆轉錄酶（P51，P66）、整合酶（P32）和蛋白酶（P11）。核心外面為病毒衣殼蛋白（P24、P17）。病毒的最外層為包膜，其中嵌有gp120和gp41兩種特異性糖蛋白。HIV基因全長約9.8kb，含有3個結構基因（gag、pol和env）、2個調節基因（tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表達調節子）和4個輔助基因（負調控因子、病毒r蛋白、病毒u蛋白和毒粒感染性因子）。在HIV病毒3個結構基因中，env的變異率最高，gag和pol比較保守。P24蛋白是gag基因編碼55kD的前體蛋白經pol基因編碼的蛋白酶的加工后產生的，因此P24蛋白氨基酸順序在HIV各病毒株之間高度保守，使P24在HIV-1感染的檢測中有一定的實用價值。
　　2 P24的臨床應用
　　P24抗原檢測技術是常用的HIV抗原檢測。在下面幾種情況中具有重要的作用。
　　2.1 HIV感染早期 抗體出現前的一段時期稱為窗口期，處于窗口期的艾滋病病毒感染者血液中雖檢測不到抗體，但血液、精液、陰道分泌物、乳汁等體液中含有艾滋病病毒而具傳染性。在此期間：血清HIV抗體陰性，可檢測到病毒RNA和病毒衣殼蛋白P24抗原，還有變化的CD4+T淋巴細胞水平。P24抗原檢測是HIV早期感染檢測的重要手段。在HIV抗體檢測中，遇到2種初篩試驗均為陽性或一陰一陽而WB陰性時，不能輕易報告陰性，尤其是近期有高危行為者或有急性流感樣癥狀者。為排除窗口期的可能，可以進行HIV-1 P24抗原或HIV核酸檢測，并于2~3個月后復查抗體，以減少漏檢率。
　　2.2 監測病程進展和預后的判斷 病毒蛋白P24抗原的增加與病毒的復制相平行。當P24抗原濃度再次在血清中升高，意味著病毒的大量繁殖和免疫系統的破壞，提示感染者進入或即將進入艾滋病期。監測P24濃度變化可以反映病情進展，為控制和治療艾滋病提供試驗依據。
　　2.3 HIV抗體不確定 P24抗原是HIV確證試驗蛋白印跡法（WB）試劑條帶中的重要組成部分。WB法HIV-1 抗體陽性：檢測出兩條env帶（gp160/gp41和gp120）及gag帶（P17 、P24 、P55）或Pol帶（P31 、P51 、P66）。WB法中，條帶P66和P24，檢出率較高，可作為常見的反應抗原，特別是P24抗原，檢出率達100%。有研究［4］表明，沒有HIV 感染危險的獻血員發生WB 不確定結果的頻率大于20 %，主要是針對P17 和P24 的反應。另有研究［5］指出，在沒有HIV 感染的人群中，HIV-1 的P24 抗體陽性率分別是：健康人群0.67 %，普通患者13 %，表皮T 細胞淋巴瘤患者24 %，孕婦0.1 %。這些結果顯示：HIV 抗體不確定結果比較常見。不確定結果絕大多數是非特異性反應，一般可能與血清標本的加熱、高膽紅素水平、溶血、類風濕因子、系統性紅斑狼瘡、多次輸血或使用血液制品等因素有關，還可能與HIV 病毒抗原與宿主細胞成分的相互交叉反應有關，也與受檢者個人的生活環境有緊密關系。
　　2.4 鑒定新生兒感染，預測母嬰垂直傳播的可能性 HIV陽性孕婦所產下的嬰兒體內可能含有來自母體的抗體，抗體檢測易出現假陽性。而 P24抗原檢測可用于鑒定嬰兒是否感染，在HIV-1抗體陽性母親所生嬰兒早期的診斷中與RNA檢測相當，與HIV核酸檢測具有可比性，具有重要的實用價值。
　　2.5 藥物療效評價 隨著技術的進展，檢測靈敏度不斷提高，P24抗原的檢測逐漸從主要用于窗口期輔助診斷，發展到用于臨床療效評價。我國HIV感染者和艾滋病患者大部分是在基層且分布廣，病毒載量檢測費用高，對儀器和操作人員要求也高，很難在基層普及，很大地阻礙了疾病的控制。P24抗原檢測成本低、操作簡單，易于普及。
　　3 P24抗原的檢測
　　HIV-1 P24抗原檢測主要有酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫熒光分析技術（IFA）等技術。其中酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定P24抗原技術是檢測HIV感染最敏感的方法。其原理是用已知抗體包被固相載體，加入待測血清，若血清中含有P24抗原則與抗體結合形成抗原抗體復合物，再加入酶標記抗體與抗原結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，加底物顯色，在酶標儀讀取結果。此法易受干擾物質影響產生假陽性，因此需用中和試驗加以驗證。由于HIV-1感染者P24抗原含量少且在病情發展過程中形成抗原抗體復合物影響P24抗原檢出，另外方法靈敏度低，使P24抗原在HIV感染診斷中與病毒核酸檢測相比沒有優勢。近年來，新的抗原檢測方法大幅度提高了檢測靈敏度［6］，主要有以下幾種。
　　3.1 免疫復合物裂解檢測法（ICD） 該法是用酸、堿處理或加熱的方法使抗原抗體復合物分離，從而增加P24抗原的濃度，提高P24檢測的敏感性和陽性檢出率，熱處理方法比酸堿處理方法更能提高P24的陽性檢出率。一般認為P24-ICD 的檢測敏感性為90 %［7］。
　　3.2 超敏感酶免疫測定法（UEI） 該法是利用高親和力抗體濃縮富集血清中的P24抗原，然后進行檢測P24。該法敏感性好，特異性強，檢測閥值為0.24 pg／mL，并且與HIV抗體的ELISA檢測相比，可提前12~20 d檢測到P24抗原。
　　3.3 免疫吸附電鏡法（ISEM） 該法是將抗原與抗體的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結合，實現對病毒顆?；虿《究扇苄钥乖闹苯犹禺愋詸z測，靈敏度高，但需要精密儀器，操作較復雜。
　　
　　3.4 線性免疫酶測定（LIA） 是第4代HIV抗原檢測技術［8］，具有較好的敏感性，縮短了檢測窗口期3～6 d，特異性高達99.84%，檢測閾值為0.01pg/mL。
　　3.5 熒光聯結抗原定量法（FLAQ） 該法是將抗P24／P27單克隆抗體包被的聚苯乙烯微球與待測樣品、熒光標記物的抗P24／P27以及裂解液混合后孵育，再借助流式細胞儀直接測定單個微球上的熒光強度，不需洗去未結合的檢測抗體，再做出標準曲線對P24／P27抗原進行定量分析［9］。該方法操作簡單，實用性強，檢測限為0.1～100 ng／mL。
　　4 P24抗原的應用總結
　　在人體感染HIV后的10～14 d內，病毒RNA水平是呈指數上升，之后下降并保持在持續穩定的水平，機體進入HIV無癥狀期［10］。P24抗原水平隨著病毒RNA水平的發展而發展，在急性感染期就可出現，被認為是病毒復制的間接性標志。P24的氨基酸序列高度保守，臨床檢測穩定，其出現又早于抗體，可作為HIV早期感染的重要指標，是窗口期的主要檢測手段之一。P24的常規檢測方法是ELISA，新的靈敏度高的方法主要有免疫復合物裂解檢測法（ICD）、超敏感酶免疫測定法（UEI）、免疫吸附電鏡法（ISEM）和線性免疫酶測定（LIA）。用高靈敏度的P24檢測方法診斷艾滋病將有助于疾病早期診斷，避免漏檢，同時可對治療艾滋病藥物進行療效評估、判斷預后和監測疾病進程，也在預防母嬰垂直傳播和抗體不確定等方面有一定用途，并已應用在第四代艾滋病檢測的ELISA試劑盒中，臨床價值較大。2004年來自美國馬里蘭大學的Dr.Gallo［11］的實驗室的1篇有關高靈敏度檢測P24抗原的研究綜述指出：P24抗原檢測方法的靈敏度得以大幅提高，并認為這可以作為低成本、適合在發展中國家使用的替代昂貴的RNA測定方法的一種方法。目前P24抗原的檢測靈敏度仍較低，還不能完全替代病毒RNA測定。進一步提高檢測的靈敏性，是P24診斷方法改進和試劑開發的主要方向。
　　
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