超聲-表面活性劑法提取黃柏生物堿工藝研究

　　 摘 要：目的：研究超聲-表面活性劑法在黃柏生物堿提取工藝中的應用。方法：采用單因素實驗和正交實驗考察不同因素對超聲-表面活性劑法提取生物堿的影響，優化最佳工藝參數。結果：最佳提取工藝為提取溫度60 ℃，乙醇濃度80%，活性劑TW60，料液比為30∶1，超聲30 min，提取率達到7.24%，高于文獻值6.37%。結論：超聲-表面活性劑對黃柏生物堿的提取，具有提取率高、快速、有效等優點。
　　關鍵詞：超聲提取；表面活性劑；黃柏；生物堿
　　中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A
　　文章編號：1007-2349（2011）08-0059-03
　　
　　黃柏為蕓香科植物黃皮樹（Phellodendron chinese Schneid）的干燥樹皮，性苦、寒，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效［1］。現代藥理學表明黃柏具有較強的廣譜抗菌性，對葡萄球菌有較強的抑制作用［2］，同時具有抗潰瘍、降壓、抗心律失常等作用。黃柏生物堿為其主要有效成分［3］，具有抗心律失常，抗心力衰竭，抗腫瘤等活性［4］。
　　超聲提取（Ultrasonic extraction）技術主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，同時可以使藥物組織內部的溫度瞬時升高，加速有效成分的溶解［5］。表面活性劑［6］是一種具有兩親結構、能夠在界面上富集并顯著改變界面性質的特殊化學物質，具有潤濕、滲透、增溶等功能特性。本文對幾種表面活性劑進行考察，與超聲技術進行結合，以鹽酸小檗堿為指標，優選出超聲—表面活性劑法提取黃柏生物堿的最佳工藝。
　　1 材料與方法
　　1.1 藥材、儀器及試劑 藥材：干燥川黃柏樹皮（購自浙江磐安中藥材市場）粉碎過40目篩，干燥保存。試劑：鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所）；去離子水；乙醇（分析純）；SDS、CATB、TW60均購自上海化學試劑公司。儀器：可見-紫外分光光度計，超聲波提取儀，waters2695液相色譜儀。
　　1.2 方法和結果
　　1.2.1 標準品液和供試液的制備 精密稱取真空干燥至恒重的鹽酸小檗堿對照品5.0 mg，加去離子水定容于100 mL容量瓶中，搖勻，即得濃度為0.05 mg/mL的鹽酸小檗堿標準品儲備液，備用。分別配質量分數0.5%的表面活性劑，裝入具塞的三角燒瓶中，之后加入川黃柏1.0 g，搖勻，超聲提取，合并濾液，定容至40 mL，分別取0.1 mL，稀釋至50 mL，搖勻，即得供試液。
　　1.2.2 標準曲線的建立 精密移取鹽酸小檗堿儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，用去離子水做空白，在345 nm波長下分別測得吸光度3次，取均值。標準曲線見圖1。用最小二乘法經線性回歸，得鹽酸小檗堿濃度C與吸光度A的回歸方程：A=64.865C-0.0053，r=0.9994。結果表明，鹽酸小檗堿在1.0~5.0 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。見圖1。
　　2 實驗內容
　　2.1 單因素實驗 為考察超聲波提取法各因素對黃柏總生物堿提取率的影響，對提取的溶劑濃度、溫度、料液比、提取時間四個因素進行單因素試驗。按2.1.2中樣品鹽酸小檗堿含量的測定步驟測吸光度，求出鹽酸小檗堿提取率。
　　2.1.1 乙醇濃度對鹽酸小檗堿提取率的影響 精密稱取黃柏藥材1 g，分別加入10%，30%，50%，70%，90%濃度的乙醇，于溫度60 ℃，超聲提取30 min，由圖2可知，30%以上濃度的乙醇對黃柏總生物堿的提取率影響總體并不顯著，在70%乙醇濃度時提取率最大，之后提取率反而隨濃度的升高有所降低，故本試驗選取60%~80%這一范圍作為考察范圍。見圖2。
　　2.1.2 溫度對提取率的影響 精密稱取黃柏藥材1 g，加入70%濃度的乙醇，于20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃的條件下超聲提取30 min，由圖3可知，30 ℃~50 ℃時對黃柏總生物堿的提取率影響總體并不顯著，在60 ℃時提取率最大，因此在試驗中均采用60 ℃。見圖3。
　　2.1.3 料液比對提取率的影響 精密稱取黃柏藥材1 g，加入70%濃度的乙醇，料液比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，于溫度60 ℃超聲提取30 min，由圖4可知，料液比高于30∶1時鹽酸小檗堿的提取率有所下降，在30∶1時提取率最大，因此本試驗選取10∶1、20∶1、30∶1這3個梯度作為考察對象。見圖4。
　　2.1.4 超聲時間對提取率的影響 精密稱取黃柏藥材1 g，加入70%濃度的乙醇，料液比30∶1于60 ℃超聲提取10、20、30、40 min，由圖5可知，超聲30 min時鹽酸小檗堿的提取率最大，超聲30 min時提取率最大，因此本試驗選取25 min、30 min、35 min 這3個梯度作為考察對象。見圖5。
　　2.2 因素水平設計 采用L9（34）正交表設計實驗，以乙醇-水為提取液，SDS、CTAB、TW60考察活性劑，以鹽酸小檗堿含量為考察指標，考察醇濃度、活性劑種類、料液比、提取時間等因素對鹽酸小檗堿提取率的影響，因素水平見表1，正交試驗結果及方差見表2、表3。
　　 由表2、表3實驗結果可知，各因素對川黃柏總生物堿提取率的影響大小順序為B（活性劑）>C（料液比）>A（乙醇濃度）>D（提取時間），最佳工藝條件為A3B3C3D2，方差分析結果表明，因素B對黃柏總生物堿有顯著性影響，因素A、D各水平間無顯著性差異。即最佳工藝為：80%乙醇，活性劑為TW60，料液比為30∶1，超聲30 min。
　　2.3 對比性實驗 見表4。
　　 對比試驗結果說明最優化條件提取率高于未加活性劑條件下的提取率，同時遠高于回流法，高于文獻值6.37%［7］，由此可見，采用表面活性劑法能明顯提高黃柏中生物堿的提取率。
　　3 討論
　　從黃柏中提取生物堿的最佳方法為：80%乙醇，活性劑為TW60，料液比為30∶1，超聲30 min，最優先條件提取率高于未加活性劑條件下的超聲提取率，同時遠高于回流法。
　　超聲波的強烈振動，有利于溶劑滲透到藥材粉末之中，加速生物堿成分的溶出和擴散，對黃柏生物堿提取率有一定的提高，表面活性劑對黃柏生物堿亦有一定的增溶效果，兩者結合考慮，對生物堿提取率有更大的提高。
　　關于鹽酸小檗堿的含量測定，實驗中曾取供試品和對照品溶液在waters液相通過DAD多波長檢測器檢測，發現200～400 nm波長范圍內，兩者均在345 nm波長處有最大吸收，且為單峰，故采用345 nm紫外分光光度法定量。
　　參考文獻：
　　［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［S］.一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：286~287.
　　［2］陳蕾，邸大琳.黃柏體外抑菌作用研究［J］.時珍國醫國藥，2006，17（5）：759~760.
　　［3］王浴生，鄧文龍，薛春生.中藥藥理與應用［M］.北京：人民衛生出版社，2002：1024~1026.
　　［4］徐小龍.生物堿的提取與分離純化技術［J］.江西科學，2009：27（3）：472~476.
　　［5］劉普和.醫學物理學［M］.北京：人民衛生出版社，1980：850.
　　［6］鐘靜芬，李文蘭.表面活性劑在秦艽生物堿提取分離中的應用［J］.甘肅醫藥，1992，11（5）：292~294.
　　［7］吳熙.超聲提取與傳統浸泡法對黃柏小檗堿提出率的比較［J］.海峽藥學，2008，20（6）：70~71.
　　（收稿日期：2011-04-01）