HPLC法測定千紫紅顆粒中楊梅苷的含量

　　摘要：目的：建立用液相色譜法測定千紫紅顆粒中楊梅苷的含量。方法：采用AgilentZORBAXXDBC18柱（Φ46mm×250mm，5μm），流動相為04%乙酸銨溶液—甲醇（65∶35），流速10mL·min-1，檢測波長260nm。結果：線性范圍6632～25628ug·mL-1，（r＝099999）；平均回收率為1006％，RSD＝086％（n＝6）。結論：該法快速、準確、可靠，可作為千紫紅顆粒的質量控制。
　　
　　
　　關鍵詞：液相色譜法；千紫紅顆粒；楊梅苷；含量
　　中圖分類號：R284文獻標識碼：A
　　文章編號：1007-2349（2011）11-0072-03
　　千紫紅顆粒收載于《衛生部藥品標準》第十一冊，由楊梅根、大紅袍、紫地榆、千里光及鉆地風5味中藥組成，具有清熱涼血、收斂止瀉之功效。用于急性腸炎、慢性腸炎急性發作以及小兒腹瀉屬濕熱癥者^[1]。千紫紅顆粒主治濕熱下注泄瀉，癥見腸鳴、腹痛腹瀉、瀉下急迫不爽、肛門灼熱、煩熱口渴等癥。通過中藥藥理試驗研究證明，千紫紅顆粒具有較強的廣譜抗菌活性，其煎劑對痢疾桿菌、傷寒桿菌及副傷寒甲/乙桿菌、綠膿桿菌及大腸桿菌等均有較強的抑制作用，在一定程度上闡明了千紫紅顆粒治療濕熱泄瀉的機理^[2]。千紫紅顆粒質量標準中缺少含量測定項，其質量研究未見報道，其藥品內在質量難以評定，本文建立了液相色譜法測定藥品中楊梅苷的含量，為千紫紅顆粒的質量控制提供了科學依據。
　　1儀器和試藥
　　WATERS2695/2996高效液相色譜儀，帶四元泵；PDA檢測器；自動進樣器；在線真空脫氣機；智能化柱溫箱及Empower化學工作站；甲醇為HPLC級，水為超純水。楊梅苷對照品購自上海同田生物技術有限公司。七批千紫紅顆粒樣品由云南白藥集團有限公司及云南白藥云健制藥有限公司提供。
　　2色譜條件
　　色譜柱：AgilentZORBAXXDBC18柱（Φ46mm×250mm，5μm）；流動相：04%乙酸銨溶液—甲醇（65∶35）；流速：10mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：260nm；進樣量：10μL。
　　3溶液的配制
　　31對照品溶液的配制精密稱取楊梅苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含楊梅苷60μg的溶液，即得。
　　32供試品溶液的配制取本品裝量差異項下的內容物，混勻，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33KHz）30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液，用045μm的微孔濾膜過濾，即得。
　　33陰性樣品溶液的配制取不含楊梅苷的陰性樣品制劑，按上述供試品溶液制備方法制備，即得陰性樣品溶液。
　　4方法與結果
　　41系統適用性將上述3種溶液按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。在此色譜條件下，楊梅苷與其它成分均能達到基線分離，千紫紅顆粒中的其它成分對楊梅苷的含量測定無干擾。
　　
　　42線性關系精密稱取楊梅苷對照品適量，置量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，再以甲醇稀釋至一系列濃度的對照品溶液，按上述色譜條件分別進樣10μL，記錄色譜圖，以峰面積（Y）對進樣濃度（X）作回歸統計，得回歸方程為Y=2265568X-2648613，r=099999（n=7），線性范圍為6632～25628μg·mL-1。
　　43精密度試驗取“31”項下的對照品溶液，按上述色譜條件，連續進樣6次，測得RSD為052％。表明儀器精密度良好。
　　44穩定性試驗取同一供試品溶液，分別于0、4、9、14、19、24h進樣測定并計算峰面積的比值。測得RSD為109％。表明供試品溶液在制備后24h內基本穩定。
　　45重復性試驗取同一樣品，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定并計算。測得RSD為033％。表明方法的重現性良好。
　　46加樣回收率試驗精密稱取已知含量的同一樣品050g，共6份，加入一定量的楊梅苷對照品溶液，揮干溶液，按“32”項下供試品溶液制備成加樣回收率供試液，并依法測定。
　　
　　5討論
　　51檢測波長的選擇試驗采用紫外可見分光光度計對楊梅苷的甲醇溶液于200～400nm波長范圍內進行掃描，結果于260nm及350nm波長處有最大吸收，此次試驗選取吸收相對較強的波長260nm為樣品檢測波長。
　　52流動相的選擇本次試驗考察了不同的流動相系統：乙腈-04%磷酸、甲醇-001mol/L磷酸二氫鉀溶液-冰醋酸^[3]、磷酸鹽緩沖液—甲醇^[4]以及04%乙酸銨溶液—甲醇，并采用PDA檢測器對楊梅苷相同保留時間處的色譜峰的進行光譜的純度掃描，結果表明，以04%乙酸銨溶液—甲醇（65∶35）為流動相時，樣品中楊梅苷的色譜峰純度、分離度，理論塔板數、峰的對稱性及出峰時間達到滿意的結果。
　　53提取溶劑的選擇楊梅苷為黃酮類化合物，易溶于甲醇、乙醇。考察了不同濃度的甲醇、乙醇為溶劑的提取結果，結果表明純甲醇的楊梅苷提取率最高。故選擇純甲醇作為提取溶劑。
　　54樣品提取方法的選擇本品方中楊梅根為水煮醇沉，本次試驗分別考察了以甲醇為溶劑的兩種提取方法，分別為加熱回流法，超聲法。這兩種提取方法中楊梅苷的含量無顯著性差別。考慮到超聲法與加熱回流法相比，超聲法更簡單，易行，快捷，故采用超聲法，以甲醇為提取溶劑。此外，本次試驗對超聲時間進行了考察，依次測定了超聲提取5min、10min、15min、30min以及60min楊梅苷含量測定的結果。結果表明采用純甲醇為溶劑，超聲提取30min時，楊梅苷成分提取完全。
　　本次試驗建立的高效液相色譜法測定千紫紅顆粒中楊梅苷的含量，該法靈敏、快速、準確，可用于千紫紅顆粒的質量控制。
　　參考文獻：
　　［1］WS3—B—2086—96［S］1996：170
　　［2］吳敏，韓建閩，張震千紫紅沖劑治療濕熱泄瀉83例臨床觀察［J］中國中醫急癥，2001，10（5）：271
　　［3］羅世恒，陳世忠，王月茹，等HPLC法測定側柏葉中楊梅苷的含量［J］陜西中醫學院學報，2010，10（3）：52~53
　　［4］謝彥瑰，陳健，黎錫流，等高效液相法測定楊梅苷脂質體的藥物含量及包封率［J］現代食品科技，2009，25（9）：1096~1098
　　（收稿日期：2011-06-21）