煙草葉片蛋白3種提取方法的比較研究

摘要：使用酚／ＳＤＳ法、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法及ＴＣＡ／丙酮沉淀法提取煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）葉片蛋白，從終產物形式、顏色、提取時間、蛋白產量、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖譜等方面對３種方法進行比較，對提取的煙草葉片蛋白進行Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測來評價３種方法提取蛋白的效果。結果表明，與２種常用方法相比，酚／ＳＤＳ法具有快速、操作方便等特點，提取的蛋白純度高、種類豐富，可用于Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測，是一種合適的提取植物組織中蛋白的方法。

關鍵詞：煙草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）葉片；蛋白；Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法；ＴＣＡ／丙酮沉淀法；酚／ＳＤＳ法

中圖分類號：Ｓ５７２；Ｑ５１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4968-03

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｔｈｒｅｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔｏｂａｃｃｏ Ｌｅａｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ

ＷＥＩ Ｙｕ－ｍｅｉ１，２，ＬＩ Ｊｉａ－ｓｕ１，ＺＨＯＵ Ｊｉｅ１，ＷＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｔａｉ１，ＬＩＵ Ｘｕｅ－ｑｕｎ１，ＣＨＥＮＧ Ｇａｎｇ１

（１．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｓｏｕｔｈ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００７4， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ） ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｐｈｅｎｏｌ／ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ， Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｃｏｌｏｒ ａｎｄ ｆｏｒｍ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｐｒｏｔｅｉｎ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｗｏ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｐｈｅｎｏｌ／ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｆａｓｔｅｒ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ， ｒｉｃｈ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｅｃｉｅｓ， ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ， ｔｈｕｓ ｗａｓ ａｎ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｔｏｂａｃｃｏ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ） ｌｅａｆ； ｐｒｏｔｅｉｎ； Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ； ＴＣＡ／ａｃｅｔｏｎｅ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ； ｐｈｅｎｏｌ／ＳＤＳ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ

蛋白質組學（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）是隨著基因組學發展而發展起來的、在整體水平上研究細胞內蛋白質的組成及其活動規律的學科。由于其能夠闡明基因表達產物——蛋白在生物體內的相對含量、修飾化信息，蛋白質與其他生物大分子的相互作用等諸多內容而日益成為現代生物學的研究熱點。在蛋白質組研究中，蛋白樣品制備是分析的起始和基礎，蛋白提取質量和效果對后續的研究分析有重要影響［１，２］。

植物組織含有較厚的細胞壁，給組織中蛋白質的提取增加了一定的難度。目前常用的植物蛋白的提取方法有兩種，一種是普通Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ提取法，該方法通過選擇適當的提取緩沖液ｐＨ，將植物中的可溶性蛋白盡可能地溶解；另一種是ＴＣＡ／丙酮沉淀法，該方法中ＴＣＡ作為蛋白質變性劑，能有效抑制絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶的活性，減少蛋白損失，因此得到較為廣泛的使用［３－6］。但以上兩種方法都不能有效地去除產物中的非蛋白物質，會對后續的研究產生不利的影響。而酚／ＳＤＳ蛋白提取法中，利用酚在ＳＤＳ這種陰離子型表面活性劑的存在條件下能充分溶解蛋白的特點，可以取得在較短的時間內充分溶解植物組織中蛋白的效果，得到的蛋白純度更高［7，8］。目前該方法在國內使用得較少，特別是在煙草樣品中尚未見報道。本研究同時使用酚／ＳＤＳ法、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法及ＴＣＡ／丙酮沉淀法３種方法從煙草葉片中提取蛋白質，從終產物形式、顏色、提取時間、蛋白產量、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳結果等方面進行比較，并使用糖基轉移酶抗體對提取的煙草葉片蛋白進行免疫學檢測，以評價３種方法提取蛋白的效果，為植物蛋白的提取和蛋白組學研究提供參考。

１ 材料與方法

１．１ 材料和試劑

煙草葉片（Ｗ３８）來自中南民族大學生命科學學院國家民委生物技術重點實驗室。主要試劑：ＮＣ膜購自Ｗｈａｔｍａｎ公司；ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｙｓｔｅｍ購自碧云天公司；Ｔｒｉｓ、三氯乙酸等化學試劑為國產分析純；糖基轉移酶多克隆抗體由北京華大蛋白技術有限公司制備。

１．２ 蛋白提取方法

１．２．１ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ提取法 準確稱取０．５ ｇ葉片，剪碎后加入０．２５ ｍＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液冰浴研磨，再加入０．７５ ｍＬ提取液（７ ｍｏｌ／Ｌ尿素、２ ｍｏｌ／Ｌ硫脲、０．４％ ＣＨＡＰＳ、１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ），研磨至勻漿后，轉移至１．５ ｍＬ離心管中，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，上清液為所需的總蛋白。

１．２．２ ＴＣＡ／丙酮沉淀法 取０．５ ｇ葉片，用液氮研磨充分，加入５ ｍＬ預冷的ＴＣＡ提取液（含質量分數１０％的ＴＣＡ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ的丙酮溶液）充分混合后，－２０ ℃放置１ ｈ；１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４ ℃離心１５ ｍｉｎ，取沉淀；再加入５ ｍＬ預冷的樣品洗滌液（２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＭＳＦ的丙酮溶液），充分混合后，－２０ ℃放置１ ｈ；１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４ ℃離心１５ ｍｉｎ，取沉淀；用密封膜封口，用針在膜上扎幾個小洞，低溫冷凍干燥。置于－８０ ℃保存或直接進行蛋白電泳。

１．２．３ 酚／ＳＤＳ蛋白提取法 取０．５ ｇ煙草樣品，液氮中研磨至粉末，快速轉移至７ ｍＬ試管，加入５ ｍＬ預冷的質量分數為１０％的ＴＣＡ丙酮溶液，振蕩混合均勻后，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４ ℃離心３ ｍｉｎ，棄上清；加入５ ｍＬ含有０．１ ｍｏｌ／Ｌ乙酸銨的體積分數為８０％的乙醇溶液，振蕩混合后１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４ ℃離心３ ｍｉｎ，棄上清；再加入５ ｍＬ體積分數８０％的丙酮，渦旋振蕩直至沉淀充分分散，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４ ℃離心３ ｍｉｎ，棄上清，室溫干燥１０ ｍｉｎ以除去剩余的丙酮，加入２．５ ｍＬ苯酚／ＳＤＳ溶液，振蕩混勻后，放置５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４ ℃離心３ ｍｉｎ；轉移上層苯酚相（約１～２ ｍＬ）至新的７ ｍＬ 管中，加入含有０．１ ｍｏｌ／Ｌ乙酸銨的乙醇溶液，置－２０ ℃中１０ ｍｉｎ或過夜，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ、４ ℃離心５ ｍｉｎ，小心棄上清。用無水乙醇洗沉淀，再用體積分數８０％的丙酮洗沉淀。最后讓蛋白自然干燥，或根據實驗需要用緩沖液溶解蛋白，保存在－８０ ℃冰箱，或直接進行蛋白電泳。

１．３ 檢測方法

考馬斯亮蘭Ｇ－２５０法測蛋白含量［9］；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳檢測，按照文獻［10，１1］所述方法進行；Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測：取發育狀況接近的煙草葉片，分別用３種方法提取總蛋白，進行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳，然后通過蛋白轉膜、麗春紅染色檢測、封閉、標記一抗、洗脫一抗、標記二抗和雜交、再洗脫、化學發光法顯色檢測結果等步驟進行分析［１2，13］。

２ 結果與分析

２．１ ３種方法提取的蛋白質質量和產量比較

對３種提取方法得到的煙草葉片蛋白形式、顏色、提取時間及蛋白產量進行比較（表１），可以看出，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ提取法所得產物為綠色，這是由色素等雜質成分未能被完全去除而導致。該方法雖提取速度快、產量高，但蛋白質量不高，所含雜質較多。ＴＣＡ／丙酮沉淀法用液氮充分研磨煙草葉片，同時加入蛋白酶抑制劑ＰＭＳＦ，降低了蛋白降解損失，故蛋白產量最高。但是多次洗脫后樣品顏色仍為淡黃色，這可能是因為煙草葉片中的一些物質能與蛋白共沉淀，導致終產物含有雜質。此外，此方法操作耗時較長，會導致蛋白樣品的損失和降解。

使用酚／ＳＤＳ法提取蛋白，酚能夠有效溶解蛋白，并在ＳＤＳ存在下，其溶解效果更好，可溶解的蛋白更多，且該方法能有效去除非蛋白物質，非蛋白類成分較其他兩種方法都少，獲得的產物為白色。雖然該方法的蛋白產量較ＴＣＡ／丙酮沉淀法低，提取所需時間長于Tris-HCl法，但蛋白較純。

２．２ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ檢測結果

使用常規的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ對３種方法獲得的煙草蛋白樣品進行比較分析，在蛋白上樣量為２０ μｇ時，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法提取的蛋白中檢測到１０個條帶，ＴＣＡ／丙酮沉淀法提取的蛋白電泳檢測出１４條條帶，酚／ＳＤＳ法提取的蛋白有１２條條帶（圖１）。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法提取的蛋白條帶較少，說明只提取到了部分蛋白，可能是該方法采用冰浴研磨，細胞破碎不夠充分，只能得到植物組織中的部分可溶性蛋白。當蛋白上樣量為４０ μｇ時，酚／ＳＤＳ法所得的蛋白條帶最多（圖２），說明該方法提取的蛋白種類最多，提取效果比較好。

２．３ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測結果

使用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ，以煙草糖基轉移酶抗體為探針檢測３種方法獲得的蛋白，結果顯示普通Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法和ＴＣＡ／丙酮法提取的蛋白均未出現任何雜交信號，只有酚／ＳＤＳ法提取的蛋白出現雜交信號（圖３），這表明酚／ＳＤＳ法提取的蛋白用于Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析能得到較好的效果。

３ 結論

３．１ 蛋白提取質量

在蛋白提取中，雜質的去除是一個主要問題［２］，本研究中酚／ＳＤＳ法提取的蛋白顏色最淺，所含雜質少，有利于后續的蛋白質組分析。另外，該方法步驟簡單，提取時間較短，能在４～５ ｈ內完成，具有操作方便、快速的特點。其他兩種方法提取的蛋白質均含有較多雜質，不利于后續實驗的進行。

３．２ 電泳和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ檢測

對３種方法提取的蛋白進行電泳檢測，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ法只提取到了部分蛋白。ＴＣＡ／丙酮沉淀法所得蛋白條帶雖多，但是該方法需要的時間長，容易產生蛋白樣品的降解，從而導致蛋白電泳結果不穩定。而酚／ＳＤＳ蛋白提取法所得條帶較多，重復性好，能夠得到良好的一維電泳圖譜。此外，本研究使用Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ對煙草葉片蛋白中的糖基轉移酶進行了檢測。結果顯示酚／ＳＤＳ法提取的煙草葉片蛋白表現良好，可用于后續分析。

酚／ＳＤＳ法提取植物蛋白，可獲得高質量和較高產量的目標產物，為有效提取植物葉片蛋白提供了有力的依據，也為后續的蛋白分析實驗打下了良好的基礎。

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