淹澇和低溫脅迫對小麥幼根BADH表達(dá)的影響

摘要：為測定淹澇和低溫脅迫下小麥幼根中甜菜堿醛脫氫酶基因ＢＡＤＨ表達(dá)的變化，將揚(yáng)麥１３種子種植于花盆土壤中，待幼苗生長至１ｃｍ左右時，隨機(jī)分為對照組、淹澇脅迫組和低溫脅迫組。對照組和淹澇脅迫組均置于２５ ℃植物培養(yǎng)箱中，其中淹澇脅迫組將花盆置于水中；低溫脅迫組置于５ ℃植物培養(yǎng)箱中。各組均處于光照／黑暗１２ ｈ交替，對照組和低溫脅迫組每日適量澆水。各組分別在０ ｈ、１２ ｈ、１ ｄ、２ ｄ、４ ｄ和８ ｄ時取根，剪取根尖處１ ｃｍ組織，提取總ＲＮＡ，逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量ＰＣＲ法測定ＢＡＤＨ表達(dá)。結(jié)果表明，低溫對ＢＡＤＨ表達(dá)的刺激作用主要表現(xiàn)在１２ ｈ和１ ｄ，表達(dá)量分別是對照的２．９倍和１６．０倍；淹澇脅迫組在１ ｄ表達(dá)升高，在２ ｄ和４ ｄ表現(xiàn)出顯著的抑制作用。小麥ＢＡＤＨ表達(dá)的變化可能與低溫抗逆性有關(guān)，而與淹澇抗逆性關(guān)聯(lián)不顯著。

關(guān)鍵詞：小麥；甜菜堿醛脫氫酶基因；淹澇；低溫

中圖分類號：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）23－4804-02

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤＨ ｉｎ Ｙｏｕｎｇ Ｒｏｏｔ ｏｆ Ｗｈｅａｔ （Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ） ｕｎｄｅｒ Ｗａｔｅｒｌｏｇ

ａｎｄ Ｌｏｗ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｓｔｒｅｓｓ

ＹＡＮ Ｊｉａｎ－ｐｉｎｇ1，ＬＩＡＮＧ Ｙａｎ1，ＴＡＮ Ｘｉａｎｇ－ｌｉｎｇ2

（１．Ｎａｎｔｏｎｇ Ｈｉｇｈｅｒ Ｎｏｒｍａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６００１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｎａｎｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｔｏｎｇ ２２６０１９，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｅｔａｉｎｅ－ａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ＢＡＤＨ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｒｏｏｔ ｏｆ ｗｈｅａｔ （Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ） ｕｎｄｅｒ ｗａｔｅｒｌｏｇ ａｎｄ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ． Ｓｅｅｄｓ ｏｆ Ｙａｎｇｍａｉ Ｎｏ．１３ ｗａｓ ｇｒｏｗｎ ｕｎｄｅｒ ｓｏｉｌ ｉｎ ｆｌｏｗｅｒｐｏｔ． Ｗｈｅｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｒｅａｃｈｅｄ １ ｃｍ ａｒｏｕｎｄ， ａｌｌ ｗｈｅａｔ ｗａｓ ｄｉｖｉｄｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ｗａｔｅｒｌｏｇｇｅｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ｒａｎｄｏｍｌｙ． Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｗａｔｅｒｌｏｇｇｅｄ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｐｌａｃｅｄ at ２５ ℃ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ； whild ｔｈｅ ｌａｔｔｅｒ ｗａｓ ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｕｎｄｅｒ ｗａｔｅｒ； ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｐｌａｃｅｄ at ５ ℃ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ． Ａｌｌ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ under ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ／ｄａｒｋ ｆｏｒ １２ ｈ ａｌｔｅｒｎａｔｅｌｙ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒ ｉｒｒｉｇａｔｅｄ ｄａｉｌｙ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｌｏｗ－ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ １ ｃｍ ｒｏｏｔ ｔｉｐ ｗａｓ ｔａｋｅｎ ｆｏｒ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ０ ｈ， １２ ｈ， １ ｄ， ２ ｄ， ４ ｄ ａｎｄ ８ ｄ ｆｒｏｍ ３ ｇｒｏｕｐｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤＨ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤＨ ｍａｉｎｌｙ ａｆｔｅｒ １２ ｈ ａｎｄ １ ｄ， ｒｅａｃｈｅｄ ２．９ ａｎｄ １６.0 ｆｏｌｄｅｒ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｗａｔｅｒｌｏｇ ｓｔｒｅｓｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤＨ ａｆｔｅｒ １ ｄ， ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤＨ ａｔ ２ ｄ ａｎｄ ４ ｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ． Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＢＡＤＨ might ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ with ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ but ｎｏｔ with ｗａｔｅｒｌｏｇ ｓｔｒｅｓｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｅａｔ； ＢＡＤＨ； ｗａｔｅｒｌｏｇ ｓｔｒｅｓｓ； ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｒｅｓｓ

淹澇和低溫為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的自然災(zāi)害。研究表明，醛脫氫酶與植物的抗逆性相關(guān)［１］。小麥?zhǔn)俏覈娜蠹Z食作物之一，我國的小麥面積、總產(chǎn)量和消費(fèi)量均居世界首位。在小麥發(fā)育的初期階段，淹澇和低溫是否對其生長產(chǎn)生不利影響，其抗逆性的機(jī)制，特別是與甜菜堿醛脫氫酶基因ＢＡＤＨ表達(dá)相關(guān)的機(jī)制研究還鮮見報道。在淹澇和５ ℃低溫環(huán)境下，研究了小麥揚(yáng)麥１３ ＢＡＤＨ相對表達(dá)量的變化，為小麥的抗?jié)晨购畽C(jī)理研究提供依據(jù)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 植物材料 將揚(yáng)麥１３種子（由江蘇省沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供）種植于花盆土壤中，待幼苗生長至１ ｃｍ時，隨機(jī)分為對照組、淹澇脅迫組和低溫脅迫組，對照組和淹澇脅迫組均置于２５ ℃植物培養(yǎng)箱中，其中淹澇脅迫組將花盆置于水中，水平面與土壤表面高度相當(dāng)；低溫脅迫組置于５ ℃植物培養(yǎng)箱中。通過培養(yǎng)箱自動控制進(jìn)行光照／黑暗１２ ｈ交替，并且每日適量澆水。各組分別在０ ｈ、１２ ｈ、１ ｄ、２ ｄ、４ ｄ和８ ｄ時取根，剪取根尖處１ ｃｍ組織待用。

１．１．２ 主要試劑與儀器 ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ總ＲＮＡ 提取試劑盒、ＳＹＢＲ?誖ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ－ＰＣＲ ＫｉｔⅡ試劑盒購自ＴａＫａＲａ公司，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；ＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ；ＡＢＩ ２７２０型ＰＣＲ儀；其他各種化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

１．２ 方法

１．２．１ 總ＲＮＡ提取 取約１ ｃｍ長根尖若干于勻漿器中，加入１ ｍＬ ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ充分研磨，至裂解液呈透明狀。轉(zhuǎn)入離心管中，室溫靜置５ ｍｉｎ，加入０．２ ｍＬ氯仿，振蕩混勻后再室溫靜置５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，吸取上清液，加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置１０ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清液，用７５％乙醇洗滌沉淀，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，棄乙醇，然后用適量的ＤＥＰＣ水溶解 ＲＮＡ。

１．２．２ 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取各個樣品總ＲＮＡ １ μＬ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，依次加入５×Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、Ｍｉｘ ０．５ μＬ、隨機(jī)引物０．５ μＬ、ＲＮＡ １ μＬ，ＤＥＰＣ水補(bǔ)足至１０ μＬ，３７ ℃保溫１５ ｍｉｎ，８５ ℃ １０ ｓ終止反應(yīng)，－２０ ℃保存。

１．２．３ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ反應(yīng) 根據(jù) ＧｅｎＢａｎｋ中登錄的目的基因ＢＡＤＨ（ＡＹ０５０３１６）和內(nèi)參ａｃｔｉｎ （ＡＢ１８１９９１）序列，應(yīng)用ＮＣＢＩ Ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ工具（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ－ｂｌａｓｔ／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉ？ＬＩＮＫ＿ＬＯＣ＝ＢｌａｓｔＨｏｍｅ）設(shè)計引物。ＢＡＤＨ的正向引物為５′－ＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴＴＧＡＣＧＣＧＧＧ－３′，反向引物為５′－ＡＣＣＡＣＴＡＣＡＡＡＧＧＣＣＧＧＣＧＣ－３′，預(yù)期產(chǎn)物長度為２７５ ｂｐ；ａｃｔｉｎ的正向引物為５′－ＧＣＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣ－３′，反向引物為５′－ＣＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＡＡＡ－３′，預(yù)期產(chǎn)物長度為２２９ ｂｐ。

以上述方法逆轉(zhuǎn)錄合成的ｃＤＮＡ為模板，按照ＳＹＢＲ?誖 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ ＩＩ試劑盒說明操作，每管總反應(yīng)體積為２５ μＬ，其中ｃＤＮＡ模板２ μＬ，上下游引物（１０ ｐｍｏｌ／Ｌ）各１ μL，２×Ｍｉｘ １２．５ μＬ，水８．５ μＬ。以ａｃｔｉｎ為內(nèi)參，并設(shè)３個重復(fù)管，以０ ｈ為參考進(jìn)行相對定量分析，ＡＢＩ ７５００ Ｓｏｆｔｗａｒｅ V２．０．４進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００３軟件作圖。

２ 結(jié)果與分析

在各時間點(diǎn)上，對照組ＢＡＤＨ表達(dá)變化不顯著；淹澇脅迫組在１ ｄ表達(dá)升高，２ ｄ和４ ｄ表達(dá)被顯著抑制，表達(dá)量分別為對照的０．１６和０．２４倍；低溫脅迫組在１２ ｈ和１ ｄ時，表達(dá)量分別是對照的２．９倍和１６．０倍，其他時間點(diǎn)的變化不顯著。淹澇脅迫組和低溫脅迫組ＢＡＤＨ表達(dá)變化走勢表現(xiàn)出一定的平行性，但都與對照組不平行（表１、圖１）。

３ 討論

植物抗逆境機(jī)理的研究始終是農(nóng)業(yè)種植業(yè)的研究熱點(diǎn)，對培育抗逆優(yōu)良品種具有重要的指導(dǎo)作用。揚(yáng)麥１３是優(yōu)質(zhì)抗病弱筋專用小麥新品種，與揚(yáng)麥９號一同成為長江下游弱筋小麥優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)帶建設(shè)核心品種之一，適宜在沙壤土地區(qū)種植。淹澇和低溫是長江下游常見的環(huán)境因素，而有關(guān)揚(yáng)麥１３對淹澇和低溫脅迫反應(yīng)的分子機(jī)制研究尚未見報道。

植物中存在多種醛脫氫酶［２］，甜菜堿醛脫氫酶是研究較多的醛脫氫酶之一，與多種非生物脅迫相關(guān)［３］，其中鹽脅迫的有關(guān)文獻(xiàn)報道較多。李永華等［４］比較了抗旱性不同的小麥品系在不同干旱脅迫下，不同生長期中ＢＡＤＨ的表達(dá)水平，認(rèn)為ＢＡＤＨ亦與干旱脅迫抗性相關(guān)；有學(xué)者通過ＢＡＤＨ轉(zhuǎn)基因方法，使作物獲得了更強(qiáng)的抗逆性［５，６］。研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫在１２ ｈ和１ ｄ時，對ＢＡＤＨ表達(dá)具有較為顯著的刺激作用，其他時間不明顯，而淹澇脅迫對ＢＡＤＨ表達(dá)除１ ｄ時有一定的刺激作用外，在２ ｄ和４ ｄ時，表現(xiàn)出顯著的抑制作用，表明小麥對淹澇脅迫與低溫脅迫的反應(yīng)機(jī)制存在差異，ＢＡＤＨ的表達(dá)變化可能與低溫抗逆性相關(guān)而與淹澇抗逆性關(guān)聯(lián)不大。淹澇脅迫抑制ＢＡＤＨ表達(dá)的生理作用還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＭＡＧＮＥＳＣＨＩ Ｌ， ＰＥＲＡＴＡ Ｐ． Ｒｉｃｅ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ［Ｊ］． Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙ， ２００９，１０３：１８１－１９６．

［２］ 黃 方，遲英俊，何 慧，等． 大豆醛脫氫酶基因ＧｍＡＬＤＨ３－１的克隆及在生殖器官中的表達(dá)［Ｊ］．遺傳，２０１０，３２（５）：４９２-４９７．

［３］ ＫＨＡＮ Ｍ Ｓ， ＹＵ Ｘ， ＫＩＫＵＣＨＩ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｅｔａｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ａｂｉｏｔｉｃ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］． Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，２６：１２５－１３４．

［４］ 李永華，王 瑋，楊興洪，等．干旱脅迫下不同抗旱性小麥ＢＡＤＨ 表達(dá)及甜菜堿含量的變化［Ｊ］．作物學(xué)報，２００５，３１（４）：４２５－４３０．

［５］ 張 寧，司懷軍，栗 亮，等．轉(zhuǎn)甜菜堿醛脫氫酶基因馬鈴薯的抗旱耐鹽性［Ｊ］． 作物學(xué)報，２００９，３５（６）：１１４６-１１５０．

［６］ 羅曉麗，肖娟麗，王志安，等． 菠菜甜菜堿醛脫氫酶基因在棉花中的過量表達(dá)和抗凍耐逆性分析［Ｊ］．生物工程學(xué)報，２００８，２４（８）：１４６４－１４６９．