大腸桿菌感染對家蠅幼蟲ACP\\POD活性的影響

摘要：觀察家蠅（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）三齡幼蟲針刺感染大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）后４、８、１２、１６ ｈ血清和血細胞中酸性磷酸酶（ＡＣＰ）、過氧化物酶（ＰＯＤ）活性的變化。結果表明，大腸桿菌感染后各時間組家蠅三齡幼蟲血清和血細胞中ＡＣＰ活性顯著高于對照組（Ｐ﹤０．０１）。其中血清和血細胞中ＡＣＰ活性分別在感染８ ｈ、４ ｈ達高峰，然后逐漸下降；大腸桿菌感染后各時間組家蠅三齡幼蟲血清和血細胞中ＰＯＤ活性顯著高于對照組（Ｐ﹤０．０１）。其中血清和血細胞中ＰＯＤ活性分別在感染１２ ｈ、８ ｈ達高峰，然后逐漸下降。大腸桿菌感染后家蠅三齡幼蟲血清和血細胞中ＡＣＰ、ＰＯＤ活性均增強，提示這兩種酶在防御微生物感染過程中發揮了重要作用。

關鍵詞：家蠅（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）幼蟲；大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）；血清；血細胞；酶活性

中圖分類號：Ｒ３８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）21－4396-03

Ｔｈｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＣＰ ａｎｄ ＰＯＤ ｉｎ

Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ Ｌａｒｖａe

ＹＡＮ Ｒｏｎｇ，ＬＩＵ Ｌｉｕ，ＬＩＵ Ｈｕｉ，ＨＥ Ｌｉ－ｆａｎｇ，ＧＡＯ Ｌｕ

（Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｚｕｎｙｉ ５６３００３，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ kinds of ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｈｅｍｏｃｙｔｅ ｏｆ Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ ｌａｒｖａe， ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＣＰ） ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ） ｉｎ ｔｈｅ ３ｒｄ ｓｔａｇｅ ｌａｒｖａe ｏｆ Ｍ． ｄｏｍｅｓｔｉｃａ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｅ． ｃｏｌｉ ｆｏｒ ４，８，１２ ａｎｄ １６ ｈ were determined ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ showed that the ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＡＣＰ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｈｅｍｏｃｙｔｅ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ４，８，１２ ａｎｄ １６ ｈ（Ｐ﹤０．０１）； Tｈｅ ｐｅａｋ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｈｅｍｏｃｙｔｅ ｗｅｒｅ ａｔ ８ ｈ ａｎｄ ４ ｈ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｔ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＰＯＤ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｈｅｍｏｃｙｔｅ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ４，８，１２ ａｎｄ １６ ｈ（Ｐ﹤０．０１）. Aｎｄ ｔｈｅ ｐｅａｋ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｈｅｍｏｃｙｔｅ ｗｅｒｅ ａｔ １２ ｈ ａｎｄ ８ ｈ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ａｎｄ ｔｈｅｎ ｉｔ ｇｒａｄｕａｌｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＡＣＰ ａｎｄ ＰＯＤ ｉｎ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｈｅｍｏｃｙｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ３ｒｄ ｓｔａｇｅ ｌａｒｖａe ｏｆ Ｍ． ｄｏｍｅｓｔｉｃａ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｅ． ｃｏｌｉ， suggesting ｔｈａｔ the ｔｗｏ ｅｎｚｙｍｅｓ ｐｌａｙｅｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅs ｉｎ ｔｈｅ defense ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ wｏｒｄｓ： Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ ｌａｒｖａe； Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ； ｓｅｒｕｍ； ｈｅｍｏｃｙｔｅ； ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ

昆蟲缺乏特異性免疫作用，主要依靠細胞免疫和體液免疫來完成免疫防御。昆蟲血細胞的免疫作用不僅表現為對異物的吞噬、形成結節或包囊殺死等過程［１］，在其吞噬前、吞噬過程中和吞噬后，血細胞還以脫顆粒的方式釋放多種水解酶、抗氧化酶等，在昆蟲免疫中具有重要作用。以前的研究發現家蠅幼蟲感染大腸桿菌后血細胞總數增加、漿血胞和粒血胞參與感染后的免疫［２］，同時感染后家蠅幼蟲血清中酸性磷酸酶（ＡＣＰ）活性增強，但感染后血清中ＡＣＰ的活性增強是否由血細胞釋放參與家蠅幼蟲免疫尚不清楚。本實驗對大腸桿菌感染后的家蠅三齡幼蟲血細胞中ＡＣＰ的酶活性變化進行測定，并對昆蟲體內重要的抗氧化酶ＰＯＤ的活性變化進行研究，觀察外源微生物入侵對這兩種酶活性的影響，以期為其免疫功能及作用機制研究提供參考資料。

１材料與方法

１．１材料與儀器

１．１．１家蠅蟲源由貴陽醫學院吳建偉教授惠贈。

１．１．２大腸桿菌４４１８４遵義醫學院微生物學教研室惠贈。

１．１．３試劑酸性磷酸酶（ＡＣＰ）試劑盒、過氧化物酶（ＰＯＤ）試劑盒均為南京建成生物工程研究所產品。

１．１．４儀器細胞超聲粉碎儀（Ｓｏｎｉｐｒｅｐ１５０型 ＭＳＥ Ｅｎｇｌａｎｄ）；Ｕ－３０１０紫外分光光度計（ＨＩＴＡＣＨＩ，日本）。

１．２方法

１．２．１家蠅三齡幼蟲飼養參照文獻［３］的方法飼養家蠅幼蟲至孵化后第４天備用。幼蟲飼料配方為麥麩１００ ｇ，奶粉１ ｇ，紅糖１ ｇ，水２００ ｍＬ。室溫２５～２８ ℃，濕度３５％～４０％。

１．２．２針刺感染家蠅三齡幼蟲３號昆蟲針蘸取濃度為１×１０９CFU／ｍＬ的大腸桿菌菌液從幼蟲腹部刺入一針后，置于飼料中飼養。分別于感染后４、８、１２、１６ ｈ測定酶活性的變化，以同時取出的未感染幼蟲作為對照組。

１．２．３家蠅幼蟲血清及血細胞的制備取上述感染組及對照組幼蟲于冰上麻醉，剪去頭端，收集血淋巴于４ ℃ ５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ（離心半徑５ ｃｍ），取上清液即為血清。沉淀血細胞中加入與血清等量的昆蟲保護液，細胞超聲粉碎儀處理３０ ｓ，反復３次，使細胞破碎成勻漿，將勻漿于４ ℃ ５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，除去沉淀即得血細胞提取液。

１．２．４感染后家蠅三齡幼蟲血清和血細胞中ＡＣＰ活性的測定分別取家蠅三齡幼蟲血清和血細胞提取液５０ μＬ用于ＡＣＰ活性的測定，具體測定方法按照試劑盒說明書操作，結果均用Ｕ／１００ ｍＬ表示。

１．２．５感染后家蠅三齡幼蟲血清和血細胞中ＰＯＤ活性的測定分別取家蠅三齡幼蟲血清和血細胞提取液２５ μＬ用于ＰＯＤ活性的測定，具體測定方法按照試劑盒說明書操作，結果均用Ｕ／ｍＬ表示。

１．２．６統計學分析所有數據均用ＳＰＳＳ １０．０軟件包處理，進行單因素方差分析， Ｐ＜０．０５為有顯著差異，Ｐ＜０．０１為極顯著差異。

２結果與分析

２．１感染后家蠅三齡幼蟲血清和血細胞中ＡＣＰ活性

如表１所示，感染大腸桿菌后各時間組血清中ＡＣＰ活性均顯著高于對照組，差異極顯著；在感染后８ ｈ活性達高峰（與感染４ ｈ比較差異極顯著），往后有降低趨勢（與感染８ ｈ比較差異極顯著）。大腸桿菌感染后各時間組血細胞中ＡＣＰ活性均顯著高于對照組（Ｐ＜０．０１）；在感染后４ ｈ活性達高峰，往后有降低趨勢（與感染４ ｈ組比較差異極顯著）。

２．２感染后家蠅三齡幼蟲血清和血細胞中ＰＯＤ活性

如表２所示，感染大腸桿菌后各時間組血清中ＰＯＤ活性均顯著高于對照組（Ｐ＜０．０１）；在感染后１２ ｈ活性達高峰（與感染８ ｈ比較差異極顯著），往后有降低趨勢（與感染１２ ｈ比較差異極顯著）。大腸桿菌感染后各時間組血細胞中ＰＯＤ活性均顯著高于對照組（Ｐ﹤０．０１）；在感染后８ ｈ活性達高峰（與感染４ ｈ比較差異極顯著），往后有降低趨勢（與感染８ ｈ比較差異極顯著）。

３討論

ＡＣＰ具有類似調理素的功能，可改變細菌等的表面結構，增強異己性，從而加快其對異物的識別、吞噬和清除［４］。本試驗發現家蠅幼蟲經大腸桿菌感染后，血清中ＡＣＰ活性增強，８ ｈ達高峰，而血細胞中ＡＣＰ活性在感染４ ｈ達高峰，然后逐漸降低。這與國外學者［５］利用Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ刺激軟體動物Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ ｇｌａｂｒａｔａ時體內ＡＣＰ活性的研究結果相符合。有學者指出在昆蟲受到病原等異物刺激時，體內與免疫活動相關的酶活性會在短時間內發生顯著的變化［6］，包括溶菌酶、酸性磷酸酶、氨肽酶等溶酶體酶。這些酶活性的升高主要是由于血細胞會在外源刺激下迅速合成這些酶類，并將其釋放到血清中，參與免疫反應。結合本試驗結果，血清ＡＣＰ活性的最高值比血細胞ＡＣＰ活性的最高值晚出現４ ｈ。推測認為，家蠅幼蟲血清中的ＡＣＰ是由血細胞分泌產生的，大腸桿菌的刺激使血細胞中的ＡＣＰ活性增高，隨后釋放到血清中，使血清中的ＡＣＰ活性也開始增高。

研究發現ＰＯＤ普遍存在于動物、植物及微生物中，是生物體中重要的抗氧化酶類之一，參與多種生理代謝反應［7］。存在于血清中的過氧化物酶（ＰＯＤ）可能參與調理作用、促進細胞黏附作用和包囊作用，它是在血細胞中形成，在酚氧化酶原系統激活后釋放到血清中的［6］。本試驗結果顯示，經大腸桿菌感染后家蠅幼蟲血清和血細胞中ＰＯＤ活性均增強，其中血清中ＰＯＤ活性在感染１２ ｈ達高峰，而血細胞中ＰＯＤ活性在感染８ ｈ達高峰，然后逐漸降低。其機制可能是：感染大腸桿菌后，血細胞在吞噬微生物的過程中產生大量的活性氧自由基，刺激血細胞分泌產生ＰＯＤ，使血細胞中ＰＯＤ活性增強。同時，病原微生物的入侵激活了酚氧化酶原系統，血細胞中的ＰＯＤ釋放到血清中，參與對氧自由基的清除，結果出現了血細胞中ＰＯＤ活性在８ ｈ達到高峰后逐漸下降的趨勢。

從本試驗家蠅幼蟲血清和血細胞中ＡＣＰ、ＰＯＤ酶活性比較來看，血清中酶活性的提高較血細胞有一定的滯后性，推測血清中的這兩種酶是由血細胞分泌產生的。本課題組已證實家蠅幼蟲血細胞可分為原血胞、漿血胞、粒血胞、珠血胞、類絳血胞５類，但感染后ＡＣＰ、ＰＯＤ的活性增強是何種血細胞釋放尚不清楚。下一步擬用酶細胞化學技術測定感染前后家蠅幼蟲血細胞中ＡＣＰ、ＰＯＤ活性的變化，以期直觀地了解家蠅幼蟲感染后何種血細胞的酶活性增強，為昆蟲感染后免疫的深入研究提供參考依據。

參考文獻：

［１］ 傅貽玲．昆蟲的血細胞（二）［Ｊ］．昆蟲知識，１９８２，１９（４）：３７－３８．

［２］ 晏容，劉暉，賀莉芳，等．感染大腸桿菌后家蠅幼蟲血淋巴細胞的觀察［Ｊ］．熱帶醫學雜志，２００８，８（７）：６４６－６４８．

［３］ 趙慰先．人體寄生蟲學［Ｍ］． 北京：人民衛生出版社，１９８３．１０５５－１０５６．

［４］ ＣＨＥＮＧ Ｔ Ｃ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｙｓｏｓｍａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｉｎ ｍｏｌｌｕｓｃａｎ ｃｅｌｌｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ［Ｊ］． Ｃｏｍｐ Ｐａｔｈｂｉｏｌ，１９７８，４：５９－７１．

［５］ ＣＨＥＮＧ Ｔ Ｃ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｌｅｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ ｏｆ Ｂｉｏｍｐｈａｌａｒｉａ ｇｌａｂｒａｔａ（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）［Ｊ］． Ｊ Ｉｎｖｅｒｔ Ｐａｔｈｏｌ，１９７９，３４：１１９－１２４．

［６］ 劉志鴻，牟海津，王清印．軟體動物免疫相關酶研究進展［Ｊ］．海洋水產研究，２００３，２４（３）：８６－９０．

［７］ 齊放軍，賈敬芬，李繼勝．脫壁酶液誘導植物細胞產生過氧化物酶抑制因子的研究［Ｊ］．實驗生物學報，１９９３，２６（３）：２８１－２８６．