一種抗真菌抗生素的分離純化及初步鑒定

摘要：從海南五指山采集的土樣中分離到一株放線菌，編號為ＷＳ－２３８８３，其發(fā)酵提取物對多種植物病原真菌具有很強的抑制活性。對其產(chǎn)物進行提取精制及制備液相純化，獲得了純度達９０％以上的化合物。生測表明，在２０ μｇ／ｍＬ濃度下該抗生素對多種植物病原真菌的抑制率達１００％。根據(jù)活性產(chǎn)物紫外吸收光譜，可判斷其為一多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。質(zhì)譜分析表明，活性化合物分子質(zhì)量約６６７ u，據(jù)此判斷其為一四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

關(guān)鍵詞：多烯大環(huán)內(nèi)酯；抗生素；化合物；純化；鑒定

中圖分類號：S476+.1文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）21－4386-03

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ Kind of Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｗｉｔｈ Ｈｉｇｈ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ

ＷＡＮ Ｚｈｏｎｇ－ｙｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｙａ－ｎｉ１，ＬＩ Ｗａｎ－ｄｅ２，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ－ｇａｎｇ１，ＺＨＵ Ｘｉａｎ１，ＷＡＮＧ Ｋａｉ－ｍｅｉ１，ＹＡＮＧ Ｚｉ－ｗｅｎ１

（１．Ｈｕｂｅｉ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ／ Subcｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ， Ｈｕｂｅｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ and Technology Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｈｕｂｅｉ Ｅｃｏ-engineering Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｗｕｈａｎ ４３０２００，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｎｅ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｔｒａｉｎ ＷＳ－２３８８３ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｗｕｚｈｉｓｈａｎ Ｍｏｕｎｔａｉｎ ａｒｅａ， Ｈａｉｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｗａｓ ｂｉｏａｓｓａｙｅｄ ｗｉｔｈ ｓｏｍｅ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ； and ｉｔ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｈｉｇｈ antifungal ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｗｉｔｈ ｐｕｒｉｔｙ ａｂｏｖｅ ９０％ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍａｃｒｏｐｏｒｕｓ ｒｅｓｉｎ ｃｏｌｕｍｎ ａｂｓｏｒｂｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ ＨＰＬＣ． Ｔｈｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｈｉｔｉｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｗａｓ １００％ ａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｔｉｏｎ ｏｆ ２０ μｇ／ｍＬ． Ｔｈｅ ＵＶ ａｂｓｏｒption ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ mａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｗａｓ ａｔｅｔｒａｅｎｅ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｌｙｅｎｅ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ； ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ； ｃｏｍｐｏｕｎｄ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

從海南五指山采集的土樣中分離到一株放線菌，其發(fā)酵提取物對多種供試植物病原真菌及某些腐生真菌具有很強的抑制活性。采用常規(guī)方法對該菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行了提取精制，得到了純度在９０％以上的樣品，從目標產(chǎn)物的紫外吸收光譜可判斷其為一多烯類抗生素。ＨＰＬＣ－ＭＳ檢測表明，活性產(chǎn)物分子離子峰為６６７，可以確定其分子質(zhì)量約為６６７ u，綜合分析后確定其為一四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

１材料與方法

１．１菌株

１．１．１抗生素產(chǎn)生菌編號為ＷＳ－２３８８３，從海南五指山采集的土樣中分離得到，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

１．１．２生測指示菌番茄灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、小麥穎枯病菌（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍ）、小麥赤霉病菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、水稻紋枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、水稻稻瘟病菌（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）、毛霉（Ｍｕｃｏｒ ｓｐ．）均為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

１．２培養(yǎng)基

１．２．１種子培養(yǎng)基葡萄糖－酵母粉－麥芽提取物培養(yǎng)基。采用帶擋板的５００ ｍＬ三角瓶，裝量１００ ｍＬ。

１．２．２抗生素發(fā)酵培養(yǎng)基甘露醇－豆胨液體培養(yǎng)基。采用帶擋板的５００ ｍＬ三角瓶，裝量１００ ｍＬ。

１．２．３生測培養(yǎng)基采用ＰＤＡ培養(yǎng)基。用管碟法生測時，下層瓊脂質(zhì)量分數(shù)為１．５％，上層瓊脂質(zhì)量分數(shù)為１．０％。用９６孔板進行生測時，瓊脂質(zhì)量分數(shù) 為０．８％。

１．３主要儀器設(shè)備

Ｂ?譈ＣＨＩ ＲＯＴＡＶＡＰＯＲ Ｒ－２００型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士生產(chǎn)；分析型液相色譜儀：Ｗａｔｅｒｓ ２６９０采用２９９６二極管陣列式檢測器；制備型液相色譜儀：Ｗａｔｅｒｓ ２５２５泵，２７６７自動收集系統(tǒng)，２９９６二極管陣列式檢測器；液質(zhì)聯(lián)用分析儀：Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色譜儀，采用Ｗａｔｅｒｓ ９９６二極管陣列式檢測器，Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．０色譜工作站，美國Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ Ｑｕａｔｔｒｏ ｍｉｃｒｏ?誖四極桿質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ＥＳＩ），Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１液質(zhì)聯(lián)用分析軟件。

１．４主要試劑

色譜純級甲醇、乙腈均為天津基準試劑有限公司生產(chǎn)；分析純乙醇，西隴化工股份有限公司生產(chǎn)；大孔吸附樹脂Ｄ３５２０，南開大學化工廠生產(chǎn)；液質(zhì)聯(lián)用氮氣，購自武漢市漢陽鋼廠，純度為９９．９９９％。

１．５色譜條件

１．５．１分析條件采用美國Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為０．３ ｍＬ／ｍｉｎ。

１．５．２制備條件制備柱采用美國Ｓｕｎｆｉｒｅ ＯＢＤ Ｃ１８柱，２５０ ｍｍ×１９ ｍｍ，粒徑為１０ μｍ；柱溫為室溫；流動相為水和乙腈，進樣量為３ ０００ μＬ；流速為２７ ｍＬ／ｍｉｎ；檢測條件：二極管陣列，全波長掃描。

１．５．３質(zhì)譜檢測條件電噴霧電離（ＥＳＩ），毛細管電壓為３．５ ｋＶ，錐孔電壓為４５ Ｖ，離子源溫度為１００ ℃，干燥氣溫度為３００ ℃，脫溶劑氣體流速５００ Ｌ／ｈ，錐孔氣體流速為５０ Ｌ／ｈ。

１．６主要方法

１．６．１抗生素發(fā)酵取低溫（－２０ ℃以下）保藏的ＷＳ－２３８８３甘油管１支，在嚴格無菌條件下用吸管取１ ｍＬ甘油－菌絲懸浮物轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機上２８ ℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)４ ｄ后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為１０％（Ｖ／Ｖ），相同條件下培養(yǎng)５ ｄ后結(jié)束發(fā)酵。

１．６．２發(fā)酵液處理將發(fā)酵液用稀鹽酸調(diào)ｐＨ值至５．０后，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，將菌絲體和上清液分開。

１．６．３上清液過柱及洗脫將經(jīng)預處理的大孔吸附樹脂裝入５０ ｍｍ×１ ０００ ｍｍ四氟砂芯玻璃柱中，將上清液以１０倍柱料體積，按ＢＶ＝０．５～１．０的流速過柱，再以４倍于柱料體積的純凈水洗滌，用２倍于柱料體積的７５％（Ｖ／Ｖ）乙醇洗脫，每２００ ｍＬ收集１份。

１．６．４菌絲體萃取稱取菌絲體質(zhì)量（濕體），加入２倍體積的７５％（Ｖ／Ｖ）乙醇，充分攪勻后，轉(zhuǎn)入帶擋板的５００ ｍＬ三角瓶中，每瓶裝量２００ ｍＬ，置搖床上１８０ ｒ／ｍｉｎ振蕩萃取１ ｈ，然后于５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，倒出上清。菌絲殘渣用同樣的方法再萃取１次。合并２次萃取液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在５０ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ，７ kＰａ壓力下濃縮至原體積的１／５，置４ ℃靜置過夜析出結(jié)晶。

１．６．５樣品干燥將上述結(jié)晶物離心，再以純水洗滌，再次離心以去掉可溶性雜質(zhì)。將沉淀物用純水懸浮，轉(zhuǎn)入不銹鋼凍干盒中，冰凍干燥，即得奶黃色疏松粉末。過柱后的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后冰凍干燥。

１．６．６樣品活性測定稱取１ ｍｇ樣品，加入純水，溶解后制得１ ０００ μｇ／ｍＬ溶液。以毛霉為指示菌，用管碟法測定樣品活性。

１．６．７樣品分析稱取上述樣品１ ｍｇ，加入１ ｍＬ甲醇溶解，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，再以Ｍｉｌｌiｐｏｒｅ ０．５ μｍ膜過濾，ＨＰＬＣ分析，進樣量３ μＬ。

２結(jié)果與分析

２．１提取物活性測定

生物活性測定結(jié)果表明，ＷＳ－２３８８３的提取物對５種真菌菌絲的抑制率均達到１００％，表明其有很強的抗真菌作用。

２．２精制樣品分析

生測及ＨＰＬＣ分析（圖１）表明，樣品中主要活性物質(zhì)保留時間為１４．０２ ｍｉｎ，雜質(zhì)峰很小，用面積積分法算出樣品純度在９０％以上。

從樣品紫外吸收光譜（圖２）來看，呈典型的指狀吸收峰，最大吸收波長為２９１、３０４、３１９ ｎｍ，以３０４ ｎｍ吸收最強。根據(jù)文獻資料［１，２］，該化合物應(yīng)屬多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

２．３樣品ＨＰＬＣ－ＭＳ分析

從質(zhì)譜圖（圖３）可以看出，在正離子和負離子質(zhì)譜中各有一個較強的峰，分別為６６８.0和６６６．３，因而對應(yīng)的分子離子峰為６６７，從而確定該活性化合物分子質(zhì)量為６６７ u。查已知多烯類抗生素數(shù)據(jù)可知，與該化合物最相近的是匹馬菌素（Ｐｉｍｉｒｉｃｉｎ）［３，４］，其分子質(zhì)量為６６５．７ u。兩者質(zhì)量數(shù)相差１個單位，是儀器誤差還是二者非同一物質(zhì)，尚待進一步分析。

３小結(jié)與討論

多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類具有多個共軛雙鍵的抗生素，其紫外吸收呈指狀，特征非常明顯，因而根據(jù)紫外吸收光譜很容易判斷。根據(jù)共軛雙鍵的數(shù)目，多烯類抗生素可分為三烯、四烯、五烯、六烯、七烯等５類。由于共軛雙鍵的向紅效應(yīng)，其最大吸收波長會隨著雙鍵數(shù)目的增加而增加，根據(jù)最大吸收波長即可判斷此類抗生素的歸屬［２］。

多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通常具有很強的抗真菌活性，且抗真菌譜廣，對絲狀真菌、酵母等均有活性。其最大弱點是對紫外光很敏感，因而多用在醫(yī)療方面，如制霉菌素（四烯）、兩性霉素Ｂ（七烯）常用于抗真菌感染，納他霉素［４］（四烯）可用于醫(yī)藥及食品添加劑，等等。

多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素也有用于防治農(nóng)作物病害的例子，如菲律賓菌素［３］（五烯）可用于防治農(nóng)作物曲霉、青霉病，梧寧霉素（四霉素，四烯）可用于防治水稻稻瘟病［５］、蘋果腐爛病［６］等。很多農(nóng)作物真菌病害如蘿卜、白菜根腫病，棉花黃萎病，西瓜枯萎病等是通過土壤傳播的，多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在土壤中使用可大大削弱紫外線的作用，因而有可能用于作物土傳性真菌病害的防治。

致謝：本項研究中，錢瑩、錢臘榮、王燕為放線菌ＷＳ－２３８８３的發(fā)酵、提取及濃縮做了很多工作，董新愿、張遵霞、舒貴芳在生測方面給予了大力支持，謹此致謝。

參考文獻：

［１］ ＭＵＲＡ Ｓ． Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ［Ｊ］． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９７０（８）：１３９－１５０．

［２］ 顧覺奮．分離純化工藝原理［Ｍ］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，１９９６．３０１－３０６．

［３］ 張志平，姚天爵．抗生素與微生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)［Ｍ］．北京：化學工業(yè)出版社，２００５．３６２．

［４］ 梁景樂． 納他霉素高產(chǎn)菌株空間育種、工藝優(yōu)化及工業(yè)放大研究［Ｄ］．杭州：浙江大學，２００５．

［５］ 韓潤亭，張金花，任金平，等．生物農(nóng)藥梧寧霉素防治水稻稻瘟病田間藥效試驗［Ｊ］．現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，２００８（１４）：１１２－１１３．

［６］ 董德鑫，邢歧，李文珍，等．梧寧霉素發(fā)酵液防治蘋果腐爛病試驗［Ｊ］．中國果樹，１９９０（２）：３４－３５．