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一種抗真菌抗生素的分離純化及初步鑒定

2011-12-31 00:00:00萬中義張亞妮李萬德等
湖北農(nóng)業(yè)科學 2011年21期

摘要:從海南五指山采集的土樣中分離到一株放線菌,編號為WS-23883,其發(fā)酵提取物對多種植物病原真菌具有很強的抑制活性。對其產(chǎn)物進行提取精制及制備液相純化,獲得了純度達90%以上的化合物。生測表明,在20 μg/mL濃度下該抗生素對多種植物病原真菌的抑制率達100%。根據(jù)活性產(chǎn)物紫外吸收光譜,可判斷其為一多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。質(zhì)譜分析表明,活性化合物分子質(zhì)量約667 u,據(jù)此判斷其為一四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

關(guān)鍵詞:多烯大環(huán)內(nèi)酯;抗生素;化合物;純化;鑒定

中圖分類號:S476+.1文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2011)21-4386-03

Isolation, Purification and Preliminary Identification of A Kind of Antibiotic with High Antifungal Activity

WAN Zhong-yi1,ZHANG Ya-ni1,LI Wan-de2,ZHANG Zhi-gang1,ZHU Xian1,WANG Kai-mei1,YANG Zi-wen1

(1.Hubei Biopesticide Engineering Research Center / Subcenter of Biopesticide, Hubei Agricultural Science and Technology Innovation Center, Wuhan 430064, China; 2.Hubei Eco-engineering Vocational College,Wuhan 430200,China)

Abstract: One actinomyces strain WS-23883 was isolated from soil sample collected in Wuzhishan Mountain area, Hainan province. The extraction of the fermentation broth was bioassayed with some plant disease pathogens; and it exhibited high antifungal activity. The compound with purity above 90% was obtained through macroporus resin column absorbtion method and preparative HPLC. The bioassay showed that the inhitition ratio was 100% at the concentrition of 20 μg/mL. The UV absorption spectrum and mass spectrum showed that the compound was atetraene macrolide antibiotic.

Key words: polyene macrolide; antibiotic; compound; purification; characterization

從海南五指山采集的土樣中分離到一株放線菌,其發(fā)酵提取物對多種供試植物病原真菌及某些腐生真菌具有很強的抑制活性。采用常規(guī)方法對該菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行了提取精制,得到了純度在90%以上的樣品,從目標產(chǎn)物的紫外吸收光譜可判斷其為一多烯類抗生素。HPLC-MS檢測表明,活性產(chǎn)物分子離子峰為667,可以確定其分子質(zhì)量約為667 u,綜合分析后確定其為一四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

1材料與方法

1.1菌株

1.1.1抗生素產(chǎn)生菌編號為WS-23883,從海南五指山采集的土樣中分離得到,由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.1.2生測指示菌番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、小麥穎枯病菌(Septoria nodorum)、小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、毛霉(Mucor sp.)均為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1種子培養(yǎng)基葡萄糖-酵母粉-麥芽提取物培養(yǎng)基。采用帶擋板的500 mL三角瓶,裝量100 mL。

1.2.2抗生素發(fā)酵培養(yǎng)基甘露醇-豆胨液體培養(yǎng)基。采用帶擋板的500 mL三角瓶,裝量100 mL。

1.2.3生測培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基。用管碟法生測時,下層瓊脂質(zhì)量分數(shù)為1.5%,上層瓊脂質(zhì)量分數(shù)為1.0%。用96孔板進行生測時,瓊脂質(zhì)量分數(shù) 為0.8%。

1.3主要儀器設(shè)備

B?譈CHI ROTAVAPOR R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士生產(chǎn);分析型液相色譜儀:Waters 2690采用2996二極管陣列式檢測器;制備型液相色譜儀:Waters 2525泵,2767自動收集系統(tǒng),2996二極管陣列式檢測器;液質(zhì)聯(lián)用分析儀:Waters 2695高效液相色譜儀,采用Waters 996二極管陣列式檢測器,Masslynx V4.0色譜工作站,美國Micromass Quattro micro?誖四極桿質(zhì)譜儀,電噴霧離子源(ESI),Masslynx V4.1液質(zhì)聯(lián)用分析軟件。

1.4主要試劑

色譜純級甲醇、乙腈均為天津基準試劑有限公司生產(chǎn);分析純乙醇,西隴化工股份有限公司生產(chǎn);大孔吸附樹脂D3520,南開大學化工廠生產(chǎn);液質(zhì)聯(lián)用氮氣,購自武漢市漢陽鋼廠,純度為99.999%。

1.5色譜條件

1.5.1分析條件采用美國Sunfire C18柱,流動相為水和乙腈,梯度洗脫,流速為0.3 mL/min。

1.5.2制備條件制備柱采用美國Sunfire OBD C18柱,250 mm×19 mm,粒徑為10 μm;柱溫為室溫;流動相為水和乙腈,進樣量為3 000 μL;流速為27 mL/min;檢測條件:二極管陣列,全波長掃描。

1.5.3質(zhì)譜檢測條件電噴霧電離(ESI),毛細管電壓為3.5 kV,錐孔電壓為45 V,離子源溫度為100 ℃,干燥氣溫度為300 ℃,脫溶劑氣體流速500 L/h,錐孔氣體流速為50 L/h。

1.6主要方法

1.6.1抗生素發(fā)酵取低溫(-20 ℃以下)保藏的WS-23883甘油管1支,在嚴格無菌條件下用吸管取1 mL甘油-菌絲懸浮物轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中,在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機上28 ℃、140 r/min培養(yǎng)4 d后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為10%(V/V),相同條件下培養(yǎng)5 d后結(jié)束發(fā)酵。

1.6.2發(fā)酵液處理將發(fā)酵液用稀鹽酸調(diào)pH值至5.0后,5 000 r/min離心10 min,將菌絲體和上清液分開。

1.6.3上清液過柱及洗脫將經(jīng)預處理的大孔吸附樹脂裝入50 mm×1 000 mm四氟砂芯玻璃柱中,將上清液以10倍柱料體積,按BV=0.5~1.0的流速過柱,再以4倍于柱料體積的純凈水洗滌,用2倍于柱料體積的75%(V/V)乙醇洗脫,每200 mL收集1份。

1.6.4菌絲體萃取稱取菌絲體質(zhì)量(濕體),加入2倍體積的75%(V/V)乙醇,充分攪勻后,轉(zhuǎn)入帶擋板的500 mL三角瓶中,每瓶裝量200 mL,置搖床上180 r/min振蕩萃取1 h,然后于5 000 r/min離心10 min,倒出上清。菌絲殘渣用同樣的方法再萃取1次。合并2次萃取液,置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上在50 ℃、160 r/min,7 kPa壓力下濃縮至原體積的1/5,置4 ℃靜置過夜析出結(jié)晶。

1.6.5樣品干燥將上述結(jié)晶物離心,再以純水洗滌,再次離心以去掉可溶性雜質(zhì)。將沉淀物用純水懸浮,轉(zhuǎn)入不銹鋼凍干盒中,冰凍干燥,即得奶黃色疏松粉末。過柱后的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后冰凍干燥。

1.6.6樣品活性測定稱取1 mg樣品,加入純水,溶解后制得1 000 μg/mL溶液。以毛霉為指示菌,用管碟法測定樣品活性。

1.6.7樣品分析稱取上述樣品1 mg,加入1 mL甲醇溶解,10 000 r/min離心5 min,再以Millipore 0.5 μm膜過濾,HPLC分析,進樣量3 μL。

2結(jié)果與分析

2.1提取物活性測定

生物活性測定結(jié)果表明,WS-23883的提取物對5種真菌菌絲的抑制率均達到100%,表明其有很強的抗真菌作用。

2.2精制樣品分析

生測及HPLC分析(圖1)表明,樣品中主要活性物質(zhì)保留時間為14.02 min,雜質(zhì)峰很小,用面積積分法算出樣品純度在90%以上。

從樣品紫外吸收光譜(圖2)來看,呈典型的指狀吸收峰,最大吸收波長為291、304、319 nm,以304 nm吸收最強。根據(jù)文獻資料[1,2],該化合物應(yīng)屬多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。

2.3樣品HPLC-MS分析

從質(zhì)譜圖(圖3)可以看出,在正離子和負離子質(zhì)譜中各有一個較強的峰,分別為668.0和666.3,因而對應(yīng)的分子離子峰為667,從而確定該活性化合物分子質(zhì)量為667 u。查已知多烯類抗生素數(shù)據(jù)可知,與該化合物最相近的是匹馬菌素(Pimiricin)[3,4],其分子質(zhì)量為665.7 u。兩者質(zhì)量數(shù)相差1個單位,是儀器誤差還是二者非同一物質(zhì),尚待進一步分析。

3小結(jié)與討論

多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一類具有多個共軛雙鍵的抗生素,其紫外吸收呈指狀,特征非常明顯,因而根據(jù)紫外吸收光譜很容易判斷。根據(jù)共軛雙鍵的數(shù)目,多烯類抗生素可分為三烯、四烯、五烯、六烯、七烯等5類。由于共軛雙鍵的向紅效應(yīng),其最大吸收波長會隨著雙鍵數(shù)目的增加而增加,根據(jù)最大吸收波長即可判斷此類抗生素的歸屬[2]。

多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通常具有很強的抗真菌活性,且抗真菌譜廣,對絲狀真菌、酵母等均有活性。其最大弱點是對紫外光很敏感,因而多用在醫(yī)療方面,如制霉菌素(四烯)、兩性霉素B(七烯)常用于抗真菌感染,納他霉素[4](四烯)可用于醫(yī)藥及食品添加劑,等等。

多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素也有用于防治農(nóng)作物病害的例子,如菲律賓菌素[3](五烯)可用于防治農(nóng)作物曲霉、青霉病,梧寧霉素(四霉素,四烯)可用于防治水稻稻瘟病[5]、蘋果腐爛病[6]等。很多農(nóng)作物真菌病害如蘿卜、白菜根腫病,棉花黃萎病,西瓜枯萎病等是通過土壤傳播的,多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在土壤中使用可大大削弱紫外線的作用,因而有可能用于作物土傳性真菌病害的防治。

致謝:本項研究中,錢瑩、錢臘榮、王燕為放線菌WS-23883的發(fā)酵、提取及濃縮做了很多工作,董新愿、張遵霞、舒貴芳在生測方面給予了大力支持,謹此致謝。

參考文獻:

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[2] 顧覺奮.分離純化工藝原理[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1996.301-306.

[3] 張志平,姚天爵.抗生素與微生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2005.362.

[4] 梁景樂. 納他霉素高產(chǎn)菌株空間育種、工藝優(yōu)化及工業(yè)放大研究[D].杭州:浙江大學,2005.

[5] 韓潤亭,張金花,任金平,等.生物農(nóng)藥梧寧霉素防治水稻稻瘟病田間藥效試驗[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2008(14):112-113.

[6] 董德鑫,邢歧,李文珍,等.梧寧霉素發(fā)酵液防治蘋果腐爛病試驗[J].中國果樹,1990(2):34-35.

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