產堿性纖維素酶菌株的篩選及酶學性質研究

摘要：從采集的造紙廠土樣中，篩選出ｌ株產堿性纖維素酶酶活力較高的菌株Ｈ－１，經鑒定，該菌株為革蘭氏陽性芽孢桿菌屬。發酵產酶條件和酶學性質研究表明Ｈ－１菌株的適宜發酵條件為：接種量為６％，ｐＨ ９．０，溫度為３７ ℃，此條件下的酶活力可達８．６９ Ｕ／ｍＬ，是初始酶活力（２．９３ Ｕ／ｍＬ）的３倍。該酶最適反應溫度為４０ ℃，最適反應ｐＨ ９．０。在２５～５５ ℃，ｐＨ ７．０～１１．０仍能保持６０％以上的酶活力，能較好地滿足日常洗滌的環境要求。

關鍵詞：堿性纖維素酶（ＣＭＣ酶）；菌株篩選；發酵條件；酶學性質

中圖分類號：Ｑ９３９．９６文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）21－4364-04

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ａｌｋａｌｉｎｅ－Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｉｔｓ Ｅｎｚｙｍａｉｃ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ

ＬＵ Ｊｉｎ－ｚｈｅｎ１，ＲＥＮ Ｊｕｎ１，ＹＡＮＧ Ｗｅｎ－ｃｈａｏ１，ＸＩＯＮＧ Ｈａｎ－ｇｕｏ２

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｗｕｈａｎ ４３０４１５，China；

２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ and Technology， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｐｅｒ ｍｉｌｌｓ， ｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ ｃａｌｌｅｄ Ｈ－１ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｉｌｌｕｓ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍｅ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｉｎｏｃｕｌｕｍ ａｍｏｕｎｔ ６％， ｐＨ ９．０ ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３７ ℃． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ８．６９ Ｕ／ｍＬ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ３ ｔｉｍｅｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（２．９３ Ｕ／ｍＬ）． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ａｂｏｕｔ ４０ ℃ ａｎｄ ｐＨ ９．０． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｂｏｖｅ ６０％ ａｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ２５～５５℃ ａｎｄ ｐＨ ７．０～１１．０， which ｍｅｅｔ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄａｉｌｙ ｗａｓｈｉｎｇ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： aｌｋａｌｉｎｅ－ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ enzyme（ＣＭＣ ｅｎｚｙｍｅ）； strain sｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ

纖維素酶的研究一般都以有效利用纖維素資源為主，酶作用的ｐＨ多為酸性，當添加到洗滌劑中，由于所處環境為堿性而失去活力，不能發揮作用［１］。近年來堿性纖維素酶的發現使其在洗滌工業中得到成功應用。堿性纖維素酶是纖維素酶系的一個組分，即羧甲基纖維素酶（ＣＭＣ酶），它不含有纖維素酶系的其他兩個組分（外切－β－１，４－葡聚糖苷酶和β－葡萄糖苷酶），能作用于底物ＣＭＣ（一般用羧甲基纖維素的鈉鹽）。ＣＭＣ屬大分子多糖衍生物，它被降解后生成多種相對分子質量不等的低聚糖。堿性纖維素酶在對天然纖維素（棉纖維）作用的過程中不能發生酶組分間的協同效應，不會使棉纖維受到較多的分解破壞［２，３］。它主要對棉纖維中占1０％左右非結晶區的纖維素分子起作用，對結晶區纖維素水解活力很低，因此不會明顯降低棉纖維的牢固度，并能去除侵入衣物內部的塵泥皮脂，顯著提高洗滌效果，節約洗滌活性物用量，減少環境污染，是目前世界洗滌工業發展的趨勢［４］。因此研究和開發堿性纖維素酶產品具有重要的現實意義和經濟價值。

本試驗從堿性土壤中篩選出1株產堿性纖維素酶的野生菌株，并對其搖瓶發酵產酶條件和酶學性質進行了研究，以期為工業化生產提供一定的理論參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１土樣來源取自湖北省武漢市陽邏、黃陂等地造紙廠的堿性土壤。

１．１．２培養基斜面保藏培養基配方（每升用量，下同）為：羧甲基纖維素鈉１０ ｇ，酵母膏４ ｇ，牛肉膏５ ｇ，蛋白胨５ ｇ，ＮａＣｌ ５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ，瓊脂粉１５ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調至ｐＨ ９．０。分離培養基Ａ：蛋白胨１０ ｇ，酵母膏１０ ｇ，羧甲基纖維素鈉１０ ｇ，ＮａＣｌ ５ ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ ｇ，瓊脂粉１５ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調至ｐＨ ９．０。分離培養基Ｂ：ＫＨ２ＰＯ４ ２ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １．４ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．３ ｇ，ＣａＣｌ２ ０．３ ｇ，ＦｅＳＯ４ ０．００５ ｇ，ＭｎＳＯ４ ０．００１ ６ ｇ，ＺｎＣｌ２ ０．００１ ７ ｇ，ＣｏＣｌ２ ０．００２ ｇ，ＣＭＣ ２ ｇ，瓊脂粉１５ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調至ｐＨ ９．０。種子培養基：可溶性淀粉１５ ｇ，酵母膏１０ ｇ，ＣＭＣ ５ ｇ，ＫＮＯ３ １ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ ｇ，ＦｅＳＯ４ ０．０１ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調至ｐＨ ９．０。發酵產酶培養基：可溶性淀粉１０ ｇ，酵母膏１０ ｇ，ＣＭＣ １０ ｇ，ＫＮＯ３ １ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ ｇ，ＦｅＳＯ４ ０．０１ ｇ，０．２ ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉調至ｐＨ ９．０。

１．２方法

１．２．１菌種的初篩采用剛果紅染色鑒定法［５，６］。稱取１ ｇ土樣懸浮于１０ ｍＬ無菌生理鹽水中，振蕩混勻，適當稀釋后，吸取０．２ ｍＬ土壤懸液涂布于分離培養基Ａ上，３７ ℃恒溫培養２ ｄ。待長出單菌落后挑取單菌落接種于斜面培養基上培養和保存，將保存的單菌落稀釋涂布于分離培養基Ｂ上，３７ ℃恒溫培養２ ｄ。往平板中加入適量１ ｍｇ／ｍＬ的剛果紅溶液染色１ ｈ，棄去染液，用適量１ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液洗滌１ ｈ。篩選能產生較大透明水解圈的菌株，接種到斜面培養基中保存。

１．２．２搖瓶發酵復篩將分離得到產ＣＭＣ酶的菌株活化后接入種子培養基，于３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培養２ ｄ，再將種子液按６％接種量接種于發酵產酶培養基中，于３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培養５ ｄ，所得發酵液于４ ℃、４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心1０ ｍｉｎ，取上清液測定ＣＭＣ酶活力。

１．２．３３，５－二硝基水楊酸（ＤＮＳ）試劑的配制稱取３，５－二硝基水楊酸２０ ｇ，溶入５００ ｍＬ去離子水中加熱（溫度不超過５０ ℃），于熱溶液中依次加入苯酚４ ｇ，亞硫酸鈉１ ｇ，酒石酸鉀鈉４００ ｇ，上述藥品溶于１ Ｌ 質量濃度為２0 g/L ＮａＯＨ溶液中，再用去離子水稀釋至２ Ｌ，放置一周后，過濾除去不溶物，待標定。

１．２．４酶活力的測定ＣＭＣ酶活力采用ＤＮＳ法測定［７］。用ｐＨ ９．０的０．０５ ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸－ＮａＯＨ緩沖液制備質量濃度為１％的ＣＭＣ－Ｎａ溶液，取該溶液２．０ ｍＬ于２５ ｍＬ刻度試管中，加入適當稀釋的酶液０．５ ｍＬ在特定條件下反應３０ ｍｉｎ，加入ＤＮＳ試劑３．０ ｍＬ，將試管放入沸水浴中加熱１０ ｍｉｎ，取出后迅速冷卻至室溫，用去離子水定容至２５ ｍＬ，于５４０ ｎｍ測定還原糖量。空白對照中先加ＤＮＳ再加酶液，其余步驟相同。在此條件下，每分鐘水解ＣＭＣ產生１ μｍｏｌ葡萄糖的酶量，定義為一個酶活力單位，用 Ｕ／ｍＬ表示。ＣＭＣ糖化力、濾紙糖化力、ＣＭＣ液化力的測定方法見參考文獻［８］。以上試驗重復３次，取平均值。

１．２．５搖瓶發酵條件和酶學性質研究將分離菌株Ｈ－１由斜面接至５０ ｍＬ（２５０ ｍＬ三角瓶）種子培養基中，于３７ ℃， ２００ ｒ／ｍｉｎ條件下培養２ ｄ，制成種子液，并于不同的接種量、溫度和ｐＨ條件下，接入發酵產酶培養基中以２００ ｒ／ｍｉｎ進行發酵產酶試驗，定時取樣于４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心ｌ ０ ｍｉｎ，離心后取上清液測定發酵液中的ＣＭＣ酶活力。取最適發酵條件下的發酵液在４ ℃下，于４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心1０ ｍｉｎ，取上清液，研究不同溫度、ｐＨ條件下的ＣＭＣ酶穩定性。

２結果與分析

２．１ＣＭＣ酶產生菌的篩選

利用分離培養基Ｂ經過初篩分離到能夠產生透明圈的６株菌株，其編號分別為Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ－１、Ｄ、Ｅ。將各菌株進行搖瓶發酵復篩，測定ＣＭＣ酶活力，結果（表１）表明，菌株Ｈ－１的初始酶活力最高，達到２．９３ Ｕ／ｍＬ。因此以Ｈ－１為出發菌株進行進一步研究。

２．２菌株Ｈ－１的初步鑒定

將篩選到的菌株Ｈ－１在分離培養基Ｂ上培養２ ｄ后，觀察菌落的形態特征，結果表明，菌落扁平、灰白色、邊緣波紋狀、較粘稠；革蘭氏染色和顯微鏡觀察結果表明，細胞呈桿狀、革蘭氏染色陽性、有芽孢形成，初步鑒定為芽孢桿菌屬［６］。穿刺培養結果表明該菌株在厭氧條件下無法生長，為好氧菌。

２．３菌株Ｈ－１產生酶的酶系組成

纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱，包括外切－β－１，４－葡聚糖苷酶、內切－β－１，４－葡聚糖苷酶和β－葡萄糖苷酶。ＣＭＣ糖化力主要代表外切和內切酶活力的總和；ＣＭＣ液化力可用來表征內切酶的活力；濾紙糖化力則反映了３類酶組分的協同作用［９］。對菌株Ｈ－１的粗酶液分別進行ＣＭＣ糖化力、濾紙糖化力、ＣＭＣ液化力測定，結果分別為５．２２、３．８９、４．２０ Ｕ／ｍL， 其中濾紙糖化力最低，說明菌株Ｈ－１所產生的酶不包括β－葡萄糖苷酶，ＣＭＣ糖化力與ＣＭＣ液化力相差不大，可見菌株Ｈ－１產生的大部分是內切酶。這種酶系組成上的不完全，恰恰使它在棉紡織品生物整理工藝中具有獨特用途，減少了酶制劑對織物的損害作用［１０－１２］。

２．４菌株Ｈ－１的搖瓶發酵產酶條件

２．４．１溫度的影響將菌株Ｈ－１接入發酵產酶培養基中，于不同溫度條件下振蕩培養５ ｄ，測定ＣＭＣ酶活力，結果見圖１。由圖１可知，在３７ ℃時，最有利于菌體產酶活力的提高，溫度由２０ ℃升至３７ ℃時，酶活力由０．４４ Ｕ／ｍＬ迅速上升至３．５６ Ｕ／ｍＬ；但當溫度超過３７ ℃時，酶活力又顯著下降，說明溫度對該菌株產堿性纖維素酶的影響比較大，溫度高于或者低于３７ ℃，可能會影響ＣＭＣ酶的合成，使酶活力下降。

２．４．２ｐＨ的影響將菌株Ｈ－１接入不同初始ｐＨ的發酵產酶培養基中，３７ ℃振蕩培養５ ｄ，測定ＣＭＣ酶活力，結果見圖２。由圖２可知，該菌在初始ｐＨ為９．０時酶活力達到最高值８．６９ Ｕ／ｍＬ。當ｐＨ由８．０上升到９．０時，酶活力上升迅速；ｐＨ超過９．０后，酶活力雖有下降，但趨勢較平緩，說明在堿性條件（ｐＨ＞９．０）下，該菌株產酶活力較穩定。

２．４．３接種量的影響將菌株Ｈ－１種子液以不同接種量接入ｐＨ ９．０的發酵產酶培養基中，３７ ℃振蕩培養５ ｄ，測定ＣＭＣ酶活力，結果見圖３。由圖３可知，當接種量為６％時，酶活力最高。接種量過低，發酵培養基中菌體濃度過低，不利于產酶；接種量過高時，可能由于溶氧量不足導致菌體生長受阻而抑制酶的產生。

２．５ＣＭＣ酶的酶學性質

２．５．１ＣＭＣ酶反應的最適溫度在１０～７０ ℃范圍內，以５ ℃為間隔，在不同的溫度條件下測定ＣＭＣ酶活力，結果見圖４。由圖４可知，該酶的最適反應溫度為４０ ℃， 在３０～４０ ℃間具有相對較高的酶活力。超過４０ ℃后，酶活力下降，可能是因為溫度過高會使酶蛋白變性。

２．５．２ＣＭＣ酶的熱穩定性酶液在１０～７０ ℃范圍內，以５ ℃為間隔，在不同溫度下保溫６０ ｍｉｎ后，在４０ ℃條件下測定其剩余ＣＭＣ酶活力，結果見圖５。由圖５可知，酶液在２５～５５ ℃范圍內均可保持６０％以上的活性，即該酶在２５～５５ ℃下具有較好的熱穩定性，可以適應較寬的洗滌溫度范圍。

２．５．３ＣＭＣ酶反應的最適ｐＨ將酶液分別置于不同的ｐＨ條件下測定ＣＭＣ酶活力，結果見圖６。由圖６可知，該酶的最適反應ｐＨ為９．０，且在ｐＨ ７．０～１１．０范圍內具有較高的酶活力。

２．５．４ＣＭＣ酶的ｐＨ穩定性將酶液置于不同ｐＨ環境中，于４０ ℃保溫６０ ｍｉｎ，測其剩余ＣＭＣ酶活力，結果見圖７。由圖７可知，在ｐＨ ７．０～１１．０的范圍內，酶活力均可保持在６０％以上，說明該菌株產生的ＣＭＣ酶在中、堿性條件下具有較好的穩定性。

３結論

１）篩選的野生菌株Ｈ－１為革蘭氏陽性芽孢桿菌，該菌株能產生不包括β－葡萄糖苷酶的堿性纖維素酶，從而能夠更好地應用于洗滌工業。

２）菌株Ｈ－１的適宜發酵產酶條件為：接種量為６％，ｐＨ ９．０，３７ ℃振蕩培養５ ｄ，酶活力可提高到８．６９ Ｕ／ｍＬ，是初始酶活力的３倍。

３）ＣＭＣ酶的最適反應溫度為４０ ℃，最適反應ｐＨ為９．０，在２５～５５ ℃、ｐＨ ７．０～１１．０仍能保持６０％以上的酶活力。

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