槲皮素和硫脲對野桑蠶多酚氧化酶的抑制類型

摘要：多酚氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）在昆蟲的變態發育和免疫防御中起著非常重要的作用，為開發以該酶為靶標的新型害蟲抑制劑提供理論依據，以野桑蠶（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）五齡幼蟲為材料提取多酚氧化酶，探討了槲皮素和硫脲對該酶的抑制作用。結果表明，這兩種抑制劑分別屬于競爭性和非競爭性抑制劑。

關鍵詞：野桑蠶（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）；多酚氧化酶； 槲皮素；硫脲； 抑制類型

中圖分類號：Ｓ４８２；Ｓ８８１．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）21－4399-02

Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ａｎｄ Ｔｈｉｏｕｒｅａ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ

Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ

ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇ－ｌｉａｎｇ１，ＺＨＵ Ｙｏｎｇ２

（１． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｚｈｏｕｋｏｕ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈｏｕｋｏｕ ４６６００１，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｐｌａｙｓ a ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ the immune ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｍｅｔａｍｏｒｐｈｏｓｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ of ｉｎｓｅｃｔ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｎｅｗ ｐｅｓｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ targeting at ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ， ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ａｎｄ ｔｈｉｏｕｒｅａ ｏｎ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ ｗａｓ ａｐｐｒｏａｃｈｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ａｎｄ ｔｈｉｏｕｒｅａ was ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ； ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ； ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ； ｔｈｉｏｕｒｅａ； ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｔｙｐｅｓ

多酚氧化酶（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ，ＰＰＯ）是一種含銅離子結合位點的氧化酶，廣泛存在于生物體內，它催化酚類物質氧化成醌再進一步聚合成黑色素。而黑色素對昆蟲的變態發育和防御反應具有重要的作用。昆蟲體內的多酚氧化酶一般以無活性的多酚氧化酶原形式存在于血淋巴中，它通過特異性絲氨酸蛋白酶的級聯反應而活化［１，２］。由于多酚氧化酶的來源不同，其酶學特性也不同［３］，因此對不同來源多酚氧化酶作用機理的深入探討，對于開發新型生物農藥有著重要的理論及應用價值。野桑蠶（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）是鱗翅目蠶蛾科害蟲，對桑樹危害很大，化學防治存在環境污染及害蟲的抗性增強等問題。鑒于此，檢測了抑制劑對該酶活性的影響及其抑制類型，為進一步開發以該酶為靶標的新型生物農藥提供新的思路。

１材料和方法

１．１供試材料

從重慶市北碚區蠶農桑園采集野桑蠶五齡幼蟲，保存于－２０ ℃備用。

１．２試劑和儀器

槲皮素、硫脲、鄰苯二酚、Ｌ－多巴、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００及固體硫酸銨均為上海生工產品。凝膠層析柱和紫外可見分光光度計（７５２ Ｓ型）分別為重慶泰坦貿易有限公司和上海棱光有限公司產品。

１．３方法

１．３．１多酚氧化酶的提取及純化方法［４］ 在液氮中把冰凍保存的野桑蠶五齡幼蟲研磨成細粉，加入適量預冷的磷酸鈉鹽緩沖液（ＰＢＳ，０．０２ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．０）， 在冰浴中溫和攪拌，于冰箱（４ ℃）中靜置３０ ｍｉｎ，０ ℃下離心６０ ｍｉｎ（４ ０００ ｒ/ｍｉｎ），上清液即為粗酶提取液。向其中加入固體硫酸銨至４０％飽和度，經靜置、離心后，將沉淀溶解在適量的ＰＢＳ中，然后用相同的緩沖液透析并經聚乙二醇８ ０００濃縮。將獲得的酶液加到Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００凝膠層析柱上，用ＰＢＳ緩沖液洗脫，即得到初步純化的野桑蠶多酚氧化酶提取液。

１．３．２酶活力的測定酶活力的測定方法參照文獻［５］，反應體系為：０．０２ ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ ７．０）、０．１ ｍＬ的酶液和一定濃度的Ｌ－多巴或鄰苯二酚，用分光光度計測定在４７５ ｎｍ或４１０ ｎｍ下的吸光度值， 以每分鐘、每毫克蛋白引起吸光度值改變０．００１為一個酶活力單位（Ｕ）。

１．３．３槲皮素對野桑蠶多酚氧化酶的抑制類型在反應體系（３ ｍＬ）中設定Ｌ－多巴（底物）濃度分別為０．８、１．０、１．５和２．０ ｍｍｏｌ／Ｌ。在上述底物濃度下，依次加入抑制劑（槲皮素）濃度為１００、８０、６０、４０和０ μｍｏｌ／Ｌ，將上述各濃度的效應物分別與酶液混勻，靜置５ ｍｉｎ后測定在１ ｍｉｎ時各反應體系的吸光度值，繪出槲皮素抑制野桑蠶多酚氧化酶的雙倒數圖。

１．３．４硫脲對野桑蠶多酚氧化酶的抑制類型在反應體系（３ ｍＬ）中依次加入鄰苯二酚（底物）濃度為１０．０、５．０、３．３、２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ。在上述各底物濃度下，依次加入抑制劑（硫脲）濃度為０．４、０．３、０．２、０．１、０ μｍｏｌ／Ｌ，將上述各濃度的效應物分別與酶液混勻，靜置５ ｍｉｎ后測定在１ ｍｉｎ時各反應體系的吸光度值，繪出硫脲抑制野桑蠶多酚氧化酶的雙倒數圖。

２結果與分析

２．１槲皮素對野桑蠶多酚氧化酶的影響

以Ｌ－多巴為底物，測定了不同濃度槲皮素的抑制效應，作雙倒數圖（圖１Ａ）。圖１Ａ表明，不論是否存在槲皮素，５條直線和縱軸都相交于同一個點上，也就是都具有相同的ｖｍａｘ（最大反應速度）值，并且隨著槲皮素濃度的增加米氏常數（Ｋｍ）增大，這說明槲皮素是野桑蠶多酚氧化酶的競爭性抑制劑，底物Ｌ－多巴和槲皮素是在酶的相同部位結合的。

２．２硫脲對野桑蠶多酚氧化酶的影響

以鄰苯二酚為底物，測定了不同濃度硫脲的抑制效應，作雙倒數圖（圖１Ｂ）。圖１Ｂ表明，不論是否存在硫脲，５條直線都相交于縱軸左邊橫軸上同一個點上，但彼此的截距不同，即它們的Ｋｍ值相同，而ｖｍａｘ值不同，并且反應速度隨硫脲濃度的增加而降低。以上結果說明硫脲不改變野桑蠶多酚氧化酶的Ｋｍ值，是野桑蠶多酚氧化酶的非競爭性抑制劑。硫脲和鄰苯二酚是在酶的不同部位結合的。

３討論

槲皮素是野桑蠶多酚氧化酶的競爭性抑制劑，其機理可能是槲皮素與底物結構相似，兩者含有的羥基同時與酶的活性中心競爭。酶與槲皮素結合成二元復合物后，再不能與其底物結合，從而使酶的活性得到抑制。硫脲是野桑蠶多酚氧化酶的非競爭性抑制劑，其抑制機理可能是硫脲的羰基與酶活性中心周圍的氨基、羥基等結合，生成的產物占據了酶活性中心周圍的空間，從而使酶的活性受到抑制。至于其具體的機理有待于進一步深入探討。

參考文獻：

［１］ ＡＳＨＩＤＡ Ｍ， ＢＲＥＹ Ｐ Ｔ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｕｍｅｎｔ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｄｅｆｅｎｓｅ： ｐｒｏｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ ｃａｓｃａｄｅ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｔｉｃｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａtｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９５，９２：1０６９８－１０７０２．

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［３］ ＫＡＷＡＢＡＴＡ Ｔ， ＹＡＳＵＨＡＲＡ Ｙ， ＯＣＨＩＡｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｉｎｓｅｃｔ ｐｒｏ－ｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ： ａ ｃｏｐｐｅｒ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ ａｒｔｈｒｏｐｏｄ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９５，９２：７７７４－７７７８．

［４］ 張永亮， 朱勇． 野桑蠶多酚氧化酶分離純化的試驗初報 ［Ｊ］． 蠶業科學，２００９，３５（１）：１７３－１７６．

［５］ ＢＥＮＪＡＭＩＮ Ｎ Ｄ， ＭＯＮＴＧＯＭＥＲＹ Ｍ Ｗ． Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｏｆ ｒｏｙａｌ ａｎｎ ｃｈｅｒｒｉｅｓ： ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ，１９７３，３８：７９９－８０６．