茶樹菇多糖提取及其抗氧化性能的研究

摘要：利用水浸提法提取茶樹菇（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）多糖，通過單因素試驗考察料水質(zhì)量比、浸提時間、ｐＨ、醇析時乙醇用量等４個因素對茶樹菇粗多糖得率的影響。結果表明，茶樹菇粗多糖的最佳提取條件為料水質(zhì)量比１∶１０、浸提時間２ ｈ、ｐＨ ７．５、浸提濃縮液４倍體積的９５％乙醇醇析。用乙醚和Ｓｅｖａｇｅ法純化茶樹菇多糖，并對其抗氧化性能進行了分析，發(fā)現(xiàn)茶樹菇多糖具有良好的抗氧化性能。在試驗濃度范圍內(nèi)，其總還原能力和對羥自由基、超氧陰離子自由基、脂過氧自由基的清除能力隨多糖濃度的升高而增強，且其在酸性條件下對亞硝酸根離子具有良好的清除能力。

關鍵詞：茶樹菇（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）；多糖；提取；抗氧化性

中圖分類號：Ｓ６４６；Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）21－4465-04

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅs ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ ａｎｄ Ｉｔｓ

Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ

ＨＵ Ｘｉａｏ－ｑｉａｎ，ＴＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｈｕａ，ＣＨＥＮＧ Ａｎ－ｙａｎｇ

（Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｈｕａｎｇｓｈａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｓｈａｎ ２４５０４１，Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ ｕｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ ａｓ ｓｏｌｖｅｎｔ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ， ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｈｉｇｈ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｙｉｅｌｄ ｗｅｒｅ， ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ， １∶１０； Eｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ２ ｈ； ｐＨ， ７．５ ａｎｄ ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ９５％ ｅｔｈａｎｏｌ ｔｏ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｌｃｏｈｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ， ４∶１． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｃｒｕｄｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｒｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｅｔｈｅｒ ａｎｄ Ｓｅｖａｇｅ ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｏｆ Ａ． ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ ｗａｓ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｌｅａｒｉｎｇ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｒａｄｉｃａｌ， ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｉｏｎ ｒａｄｉｃａｌ， ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｙ ｒａｄｉｃａｌ ｎｉｔｒｉｔｅ ｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｄｏｓａｇｅ in the scope of test concentration； Aｎｄ ｉｔ ａｌｓｏ ｈａｄ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｃｌｅａｒｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｎｉｔｒｉｔｅ ｉｏｎ ｉｎ ａｃｉｄｉｔｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ

食用菌是一類具有較高營養(yǎng)價值和藥用價值的食物資源［１］，近年來國內(nèi)外已對多種食用菌，如香菇、靈芝、金針菇、燈芯菇、黑木耳等，進行了水溶性多糖的提取純化、分離鑒定及功能研究［３－７］。茶樹菇（Ａｇｒｏｃｙｂｅ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）隸屬于糞銹傘科田蘑屬［２］，目前對茶樹菇多糖提取方法的研究僅見于王紅梅等［８］的熱水浸提法和毛慧玲等［９］的組合浸提法，而對茶樹菇多糖功能的研究更少［１０］。

本研究采用單因素試驗對茶樹菇多糖提取工藝中的料水質(zhì)量比、浸提時間、ｐＨ、醇析過程中乙醇用量４個因素進行優(yōu)化，并分析了純化后多糖的抗氧化性能，旨在為茶樹菇的綜合開發(fā)利用提供參考。

１材料與方法

１．１材料與儀器

新鮮茶樹菇，購于黃山市豐華大市場，由黃山學院生命與環(huán)境科學學院王世強副教授鑒定。茶樹菇多糖提取及純化、抗氧化實驗所用試劑均為分析純。儀器有ＨＨ－Ｓ數(shù)顯恒溫水浴鍋、ＴＤＬ－５臺式低速離心機、Ｒ－２０１旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、ＳＨＺ－ⅢＤ循環(huán)水真空泵、ＰＬ２０３電子精密天平、ＤＧＸ－９０７３Ｂ－２電熱鼓風干燥箱、ＫＳ－２康式振蕩器、ＵＶ７５４紫外可見分光光度計等。

１．２方法

１．２．１茶樹菇粗多糖的提取工藝及優(yōu)化取新鮮的茶樹菇子實體，去雜，洗凈，６０ ℃烘干至恒重，研成粉末備用。準確稱取１０．０ ｇ茶樹菇干粉，按１∶１０的料水質(zhì)量比加入蒸餾水，９０ ℃浸提３ ｈ，將提取液雙層紗布過濾，取上清液，重復提取３次，合并濾液，減壓濃縮至２０ ｍＬ，濃縮液加３倍體積的９５％乙醇，４ ℃下醇析２４ ｈ，棄上清液，加入２０ ｍＬ無水乙醇靜置３０ ｍｉｎ后棄上清液，洗沉淀兩次，６０ ℃烘干至恒重后稱重，粗多糖得率＝粗多糖重量／茶樹菇干粉重量×１００％。

采用單因素試驗分別考察料水質(zhì)量比、浸提時間、ｐＨ和醇析時乙醇用量對粗多糖得率的影響。①料水質(zhì)量比：分別按１∶５、１∶１０、１∶１５料水質(zhì)量比加蒸餾水；②浸提時間：分別浸提１、２、３ ｈ；③浸提液ｐＨ：浸提液的初始ｐＨ為６．５，用１ ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ和ＮａＯＨ調(diào)節(jié)ｐＨ至５．５、７．５；④醇析的乙醇用量：浸提液濃縮后分別加入２、３、４倍體積的９５％乙醇醇析。

１．２．２茶樹菇精多糖的純化及抗氧化性能研究取１．２．１制得的茶樹菇粗多糖，用乙醚洗３次脫脂，Ｓｅｖａｇｅ法去游離蛋白得茶樹菇精多糖［１１］。測定純化后的茶樹菇精多糖的總還原能力［３，１２］、清除羥自由基的能力［１３］、清除超氧陰離子自由基的能力［３］、清除脂過氧自由基的能力和不同ｐＨ條件下的亞硝酸根離子清除能力［１３］。

２結果與分析

新鮮茶樹菇烘干、研碎后，經(jīng)過浸提、濃縮和醇析，得到褐色黏稠絮狀沉淀，易溶于水，不溶于乙醇和乙醚。沉淀經(jīng)醇洗，烘干后的茶樹菇粗多糖為褐色固體，質(zhì)地疏松，有特殊香味，味微咸，極易受潮變黏稠。

２．１單因素試驗優(yōu)化茶樹菇多糖提取工藝結果

２．１．１料水質(zhì)量比對茶樹菇多糖得率的影響粗多糖得率隨著加水量的增加而上升，料水質(zhì)量比為１∶１５時粗多糖得率最大，略高于料水質(zhì)量比為１∶１０時的粗多糖得率，明顯高于料水質(zhì)量比為１∶５時的粗多糖得率（圖１），考慮到浸提液體積過大會對后續(xù)濃縮帶來不便，選料水質(zhì)量比１∶１０進行后續(xù)實驗。

２．１．２浸提時間對茶樹菇多糖得率的影響浸提２ ｈ，粗多糖得率明顯高于浸提１ ｈ，但與浸提３ ｈ的得率相差不大（圖２），為簡化提取工藝提高提取效率，選用２ ｈ的浸提時間。

２．１．３ｐＨ對茶樹菇多糖得率的影響ｐＨ ７．５條件下粗多糖得率高于ｐＨ ５．５和６．５條件下粗多糖的得率（圖３）。有研究顯示，堿浸提法所獲多糖的抗癌活性高于熱水浸提法所獲多糖的［１４］，但食用菌多糖對堿敏感，在強堿性條件下會發(fā)生水解［１５］，因此宜在弱堿性條件下提取。

２．１．４醇析時乙醇用量對茶樹菇多糖得率的影響醇析時乙醇用量對茶樹菇多糖得率影響較大，本研究中粗多糖得率隨乙醇用量增大而升高（圖４），為保證多糖能充分析出，使用４倍體積的９５％乙醇。

２．１．５驗證試驗結果根據(jù)單因素試驗結果，在料水質(zhì)量比１∶１０、９０ ℃浸提２ ｈ、ｐＨ ７．５、４倍體積９５％乙醇醇析的條件下進行驗證試驗，重復３次，得茶樹菇粗多糖的平均得率為３０．６５％。

２．２茶樹菇精多糖的抗氧化性能

２．２．１茶樹菇精多糖的總還原能力茶樹菇精多糖具有較好的還原能力，在實驗濃度范圍內(nèi)，總還原能力隨精多糖濃度的增大而增加（圖５），可以作為天然抗氧化劑使用。

２．２．２茶樹菇精多糖清除羥自由基的能力對于生物體而言，羥基自由基是最活潑的自由基，也是毒性最大的自由基，它可與活細胞中的任何分子發(fā)生反應而造成損害，且反應速度快，由它引起的自由基鏈反應可在較大范圍內(nèi)造成生物體的損害［１３］。茶樹菇精多糖具有較好的清除羥自由基的能力，在實驗濃度范圍內(nèi)，清除羥自由基的能力隨多糖濃度的增大而增加（圖６）。

２．２．３茶樹菇精多糖清除超氧陰離子自由基的能力生物體內(nèi)氧化還原反應中，大致有２％～５％的氧會產(chǎn)生超氧自由基，超氧自由基的毒性是機體發(fā)生氧中毒的主要原因，表現(xiàn)在使核酸鏈斷裂，多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化作用，進而造成遺傳突變、膜損傷、酶系失靈、線粒體氧化磷酸化作用改變等一系列變化［１６］。茶樹菇精多糖對其具有較好的清除能力，在實驗濃度范圍內(nèi)，超氧陰離子的清除率隨濃度的升高呈上升趨勢（圖７）。

２．２．４茶樹菇精多糖清除脂過氧自由基的能力乙醇在堿性有氧、強紫外線照射下光解產(chǎn)生ＣＨ３（ＯＨ）ＣＨ·，ＣＨ３（ＯＨ）ＣＨ·作為自由基引發(fā)劑直接作用于不飽和脂肪酸亞油酸產(chǎn)生Ｒ·，然后氧化形成脂過氧自由基（ＲＯＯ·）；再分解為丙二醛（ＭＤＡ）［１７］。ＭＤＡ為極活潑的交聯(lián)劑，迅即與磷酸酰乙醇胺交聯(lián)然后與蛋白質(zhì)、肽類或脂類結合成難溶性的無生理活性的色素斑點，沉積于細胞漿內(nèi)形成脂褐或老年斑。不飽和脂肪酸這種鏈鎖反應很難自動終止，除非加入氧自由基捕捉劑。茶樹菇精多糖具有較好的清除脂過氧自由基能力，在實驗濃度范圍內(nèi)，隨濃度升高其清除率呈上升趨勢（圖８），可以作為氧自由基捕捉劑來抑制不飽和脂肪酸的過氧化，從而延緩機體的衰老。

２．２．５茶樹菇精多糖在不同ｐＨ條件下清除亞硝酸根離子的能力茶樹菇精多糖具有較好的清除亞硝酸根離子的能力，２５ μｇ／ｍＬ的茶樹菇精多糖在酸性條件下對亞硝酸根離子的清除能力遠遠高于中性和弱堿性條件；１０～２０ ｍｉｎ，茶樹菇精多糖對亞硝酸根離子的清除能力逐漸增強，２０ ｍｉｎ后，ｐＨ為３的條件下，清除能力基本穩(wěn)定，其他的ｐＨ條件下，清除能力都呈下降趨勢，說明茶樹菇精多糖在模擬胃液的酸性環(huán)境條件下（ｐＨ ３）具有較好的抗氧化性能（圖９）。

３討論

本研究采用Ｓｅｖａｇｅ法去游離蛋白，是利用蛋白質(zhì)在三氯乙烷等有機溶劑中變性的特點，將提取液與Ｓｅｖａｇｅ試劑（氯仿與正丁醇體積比４∶１）混合振蕩，使樣品中蛋白質(zhì)變性，經(jīng)過離心，變性后的蛋白質(zhì)介于提取液與Ｓｅｖａｇｅ試劑交界處。多次分離至液面交界處無白色混懸。此法的優(yōu)點是條件溫和，不會引起多糖的變性，但也有重復次數(shù)多、操作不夠簡便的不足。

目前，國內(nèi)外對食用菌多糖的研究及開發(fā)利用進展得很快，許多食用菌產(chǎn)品已投放市場，以真菌多糖作為功能添加劑的保健食品也相繼出現(xiàn)，并且多種菌多糖已被制成藥品。相比于蘑菇、香菇、草菇、平菇等其他食用菌，茶樹菇是一種極具開發(fā)潛力的食用菌［１８］。本研究表明，茶樹菇精多糖具有較強的抗氧化性能。還需要加強對多糖的提取分離技術、化學結構、生物活性和構效關系等方面的研究，使其能在食品、發(fā)酵、醫(yī)療保健等領域得到廣泛的應用。

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