豬卵母細(xì)胞不同孤雌激活方法的研究

摘要：通過對(duì)不同電激活參數(shù)的摸索，電激活和化學(xué)激活聯(lián)合的研究，以確定適合于豬卵母細(xì)胞孤雌激活的最佳方案。結(jié)果表明，體外成熟豬卵母細(xì)胞在電場(chǎng)時(shí)程６０ μｓ，１次直流脈沖的條件下，電場(chǎng)強(qiáng)度１．６ ｋＶ／ｃｍ時(shí)其卵裂率（８８．６８％）和桑葚胚率（８1．１３％）較其他各組高。在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，１次直流脈沖的條件下，脈沖時(shí)程２０ μｓ時(shí)，卵母細(xì)胞卵裂率僅為７５．３８％，桑葚胚率為６４．６２％；４０和８０ μｓ時(shí)，卵裂率分別是８４．６２％和７７．１７％；１００ μｓ時(shí)，卵母細(xì)胞的卵裂率和桑葚胚率都明顯下降。在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，電場(chǎng)時(shí)程為６０ μｓ的條件下，２次電脈沖激活卵母細(xì)胞的卵裂率（８７．５０％）、桑葚胚率（８１．２５％）和１次電脈沖的卵裂率（８８．６８％）、桑葚胚率（８０．１３％）之間無顯著性差異（Ｐ﹥０．０５），但兩者均顯著高于３次電脈沖的卵裂率（７２．５０％）和桑葚胚率（70．27％）。成熟卵母細(xì)胞經(jīng)電刺激（ＥＳ）后，分別用ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）、ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）各自處理４ ｈ，ＥＳ＋ＣＢ＋ＣＨＸ和ＥＳ＋ＣＢ＋6-ＤＭＡＰ組卵裂率顯著高于其他３組，但其桑葚胚率差異不顯著。結(jié)果顯示，電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，電場(chǎng)時(shí)程６０ μｓ，１次脈沖的電刺激對(duì)體外成熟的豬卵母細(xì)胞（ＩＶＭ）孤雌激活效果最好；１次或２次電脈沖就足以激活豬卵母細(xì)胞，過高脈沖對(duì)細(xì)胞反而有傷害作用；電激活和化學(xué)激活聯(lián)合應(yīng)用可提高豬卵母細(xì)胞的卵裂率。

關(guān)鍵詞：卵母細(xì)胞；體外培養(yǎng)；孤雌激活；豬

中圖分類號(hào)：Ｑ１３２；S828文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）21－4431-04

Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｏｏｃｙｔｅｓ

ＬＩ Ｌｉ１，ＺＨＥＮＧ Ｘｉｎ－ｍｉｎ１，ＨＵＡ Ｚａｉ－ｄｏｎｇ２，ＬＩＵ Ｘｉ－ｍｅｉ１，ＢＩ Ｙａｎ－ｚｈｅｎ１，ＸＩＡＯ Ｈｏｎｇ－ｗｅｉ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Animal Husbandry and Veterinary， Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅs／Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂoratory ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ Engineering and Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ / Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Bｒｅｅｄｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ， ｔｈｅ parameters ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ activation ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ of electrical activation and chemical activation ｏｎ ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｔｕｒｅｄ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ to find the best program． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒａｔｅs ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｍｏｒｕｌａ ｏｆ ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｎｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｏｆ １．６ kＶ／ｃｍ ｆｏｒ ６０ μｓ （８８．６８% ａｎｄ ８1．１３％） ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ that in ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒａｔｅs ｏｆ ｃｌｅａｖａｇｅ ｉｎ ｏｎｅ， ｄｏｕｂｌｅ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｏｆ １．６ kＶ／ｃｍ ｆｏｒ ６０ μｓ ｗｅｒｅ ８８．６８%， ８７．５０% ａｎｄ ７２．５０％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． And the rates of morula were 80.13%， 81.25%， 65.00% respectively. The rates of cleavage and morula of the oocytes using one DC-pulse of 1.6kV/cm for 20 μｓ were 75.38%， 64.62% respectively， while for 40 and 80 μｓ， the rates of cleavage were 84.62% and 77.17% respectively. For 100 μｓ， the rates of cleavage and morula decreased remarkably. Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｄｏｕｂｌｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｏｎｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＞０．０５）， ｂｕｔ ｂｏｔｈ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｒｅｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ， ｔｈｅ ｍｏｒｕｌａ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ significant ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐｓ． Ａｆｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ activation ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＢ（7.5 μg/mL）， ＣＨＸ（10 μg/mL）， ６－ＤＭＡＰ（2 mmol/L）， ＣＢ（7.5 μg/mL）＋ＣＨＸ（10 μg/mL） ａｎｄ ＣＢ（7.5 μg/mL）＋６－ＤＭＡＰ（2 mmol/L） ４ ｈｏｕｒｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ activation ｗｉｔｈ ｏｎｅ ＤＣ－ｐｕｌｓｅ ｏｆ １．６ kＶ／ｃｍ ｆｏｒ ６０μｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ． Ｏｎｅ ｏｒ ｄｏｕｂｌｅ activation ｗａｓ ｅｎｏｕｇｈ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅ ｔｈｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ． Ｔｏｏ ｍｕｃｈ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ activation ｍｉｇｈｔ ｈｕｒｔ ｔｈｅ ｏｏｃｙｔｅｓ． The combined application of electrical activation and chemical activation could improve the rate of cleavage of oocytes.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： oｏｃｙｔｅｓ； iｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ； aｃｔｉｖａｔｉｏｎ； pｉｇｓ

在大多哺乳動(dòng)物中，排出的卵母細(xì)胞都停留在ＭⅡ期直至被精子受精激活或人工誘導(dǎo)激活才完成第二次成熟分裂。精子進(jìn)入ＭⅡ期，卵母細(xì)胞啟動(dòng)繼續(xù)發(fā)育的過程稱為卵母細(xì)胞激活。它包括一系列級(jí)聯(lián)發(fā)生形態(tài)和生理變化等激活事件。盡管細(xì)胞核移植技術(shù)的開展在牛、羊、小鼠、豬等動(dòng)物上獲得成功，但總效率仍很低，而豬的體細(xì)胞核移植效率更低，出生活仔數(shù)與移植胚的比率僅為１％左右［１－３］。很多因素影響核移植胚的發(fā)育，其中一重要因素是受體卵母細(xì)胞的激活率低，這可能是導(dǎo)致豬體細(xì)胞克隆胚的囊胚發(fā)育率很低的主要原因之一。

豬卵母細(xì)胞的激活方法很多，常用的有直流電脈沖、鈣離子載體、６－二甲氨基嘌呤、乙基汞硫代水楊酸鈉、細(xì)胞松弛素Ｂ、放線菌酮等。這些物質(zhì)相互配合使用，激活效率更高。有關(guān)電脈沖、鈣離子載體與其他因素相互結(jié)合用于激活豬卵子的研究報(bào)道較多［４－６］，但不同實(shí)驗(yàn)室在組合使用上各有不同，使用劑量、濃度和方式上差別也很大。

本試驗(yàn)的目的是通過對(duì)不同電激活參數(shù)的摸索，電激活和化學(xué)激活聯(lián)合激活的研究，確定適合于豬卵母細(xì)胞孤雌激活的最佳方案，為將來進(jìn)行轉(zhuǎn)基因克隆重構(gòu)胚的激活積累經(jīng)驗(yàn)。

１材料與方法

１．１材料

口吸管（自制），５孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Ｂｉｏｇｅｎｉｃｓ ｂｉｏＱａｄ）；ＤＰＢＳ購(gòu)自Ｇｉｂｃｏ公司；孕馬血清促性腺激素（ＰＭＳＧ）、人絨毛膜促性腺激素（HＣＧ）為寧波激素制品廠生產(chǎn)，其他試劑如未特別注明，均購(gòu)自Ｓｉｇｍａ公司（Ｓｔ． Ｌｏｕｓｅ，ＭＯ，ＵＳＡ）。試驗(yàn)中需要的溶液配制方法如下：

１）改良組織培養(yǎng)液－１９９（ｍＴＣＭ－１９９）。添加０．０５５ ０ ｇ 葡萄糖，０．０１０ ０ ｇ 丙酮酸鈉，０．００６ ９ ｇ Ｌ－半胱氨酸，０．０１４ ６ ｇ Ｌ－谷氨酰胺，０．１００ ０ ｇ 聚乙烯醇 （ＰＶＡ），雙抗１０ μＬ／ｍＬ，用ＴＣＭ－１９９液定容至１００ ｍＬ，調(diào)其ｐＨ至７．２～７．４，然后以０．２２ μｍ 針頭濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾，４ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

２）豬卵泡液（ｐＦＦ）制備。抽取卵巢上３～８ ｍｍ直徑的卵泡，將抽取液放入離心管中離心（１ ６００ ｒ／ｍｉｎ）２０ ｍｉｎ，取上清液于超凈工作臺(tái)內(nèi)，０．２２ μｍ濾膜過濾后分裝于１．５ ｍＬ 離心管中，－２０ ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

３）豬卵母細(xì)胞體外成熟液。ｍＴＣＭ-１９９＋１０ ＩＵ／ｍＬ

ＰＭＳＧ＋１０ ＩＵ／ｍＬ HＣＧ＋１０％ ｐＦＦ，培養(yǎng)卵母細(xì)胞前培養(yǎng)基至少要在ＣＯ２箱內(nèi)平衡４ ｈ。

４）胚胎培養(yǎng)液。胚胎培養(yǎng)液為北卡羅林納州大學(xué)２３培養(yǎng)液（ＮＣＳＵ－２３）添加４ ｍｇ／ｍＬ牛血清白蛋白（ＢＳＡ）。

５）脫卵丘液。?。常?ｍＬ杜氏磷酸緩沖液（ＤＰＢＳ），取１００ ｍｇ／ｍＬ透明質(zhì)酸酶，緩慢攪拌，使之溶解并用ＤＰＢＳ定容至５０ ｍＬ，然后以０．２２ μｍ 針頭濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過濾，分裝到１．５ ｍＬ離心管內(nèi)于４ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

６）細(xì)胞松弛素Ｂ（ＣＢ）。加２．５ ｍＬ二甲基亞砜（ＤＭＳＯ）溶解５ ｍｇ的ＣＢ，分裝到１．５ ｍＬ離心管，沒管０．１ ｍＬ，工作濃度為５～７．５ μｇ／ｍＬ，－２０ ℃凍存。

７）放線菌酮（ＣＨＸ）。ＣＨＸ原裝濃度１００ ｍｇ／ｍＬ；取１００ μＬ，用ＤＭＳＯ稀釋到１ ｍＬ，則濃度為１０ ｍｇ／ｍＬ，－２０ ℃凍存。如果工作濃度為１０ μｇ／ｍＬ，則每毫升溶液中加儲(chǔ)存液１ μＬ。

８）6-二甲氨基嘌呤（６－ＤＭＡＰ）。１００×的儲(chǔ)存液：用３．０６ ｍＬ ＤＭＳＯ溶解１００ ｍｇ的６－ＤＭＡＰ，分裝于１．５ ｍＬ離心管中，－２０ ℃凍存。使用時(shí)每毫升胚胎培養(yǎng)液中加１０ μＬ。

１．２方法

１）豬卵母細(xì)胞的孤雌激活與體外培養(yǎng)。體外培養(yǎng)４２～４４ ｈ的豬卵母細(xì)胞，用０．１％透明質(zhì)酸酶脫去卵丘顆粒細(xì)胞，用激活液洗滌３遍。再將其轉(zhuǎn)移到鋪滿激活液、電極寬度為１ ｍｍ的融合槽（ＢＴＸ ＥＣＭ２００１電融合儀配套電激活槽）中。

２）試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

試驗(yàn)一：體外成熟豬卵母細(xì)胞在電場(chǎng)時(shí)程為６０ μｓ，１次直流脈沖（DC）的條件下，分別用１．２ 、１．４ 、１．６、１．８和２．０ ｋＶ／ｃｍ的電場(chǎng)強(qiáng)度激活。

試驗(yàn)二：在當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，１DC的條件下，分４組分別采用２０、４０、８０、１００ μｓ的電場(chǎng)時(shí)程激活成熟的豬卵母細(xì)胞。

試驗(yàn)三：在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，電場(chǎng)時(shí)程為６０ μｓ的條件下，分２組分別采用２ＤＣ和３ＤＣ激活豬卵母細(xì)胞。

試驗(yàn)四：采用電刺激（１．６ ｋＶ／ｃｍ，６０ μｓ，１ＤＣ）豬體外成熟卵母細(xì)胞后，分別用ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）、ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）各自處理４ ｈ。激活處理之后用ＮＣＳＵ－２３＋４ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ的胚胎培養(yǎng)液洗滌卵母細(xì)胞３～５遍，洗滌后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到ＮＣＳＵ－２３＋４ ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ液滴內(nèi)，３９ ℃、５％ＣＯ２、１００％濕度的培養(yǎng)箱中４８ ｈ觀察細(xì)胞發(fā)育的卵裂情況。

１．３數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用卡方（χ２）檢驗(yàn)。

２結(jié)果與分析

２．１不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

由表１可見，在電場(chǎng)時(shí)程６０ μｓ，１ＤＣ的條件下，場(chǎng)強(qiáng)在一定范圍內(nèi)增大，卵母細(xì)胞的卵裂率逐漸提高，但各組之間差異不顯著。電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ時(shí)豬卵母細(xì)胞的卵裂率（８８．６８％）和桑葚胚率（８1．１３％）較其他各組高；當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)繼續(xù)增大時(shí)，其卵裂率和桑葚胚率均下降。表明過高的脈沖強(qiáng)度不僅不會(huì)促進(jìn)其激活效果，反而對(duì)細(xì)胞有損傷作用。

２．２不同電場(chǎng)時(shí)程對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

由表２可見，在當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，１DC的條件下，脈沖時(shí)程２０ μｓ時(shí)，豬卵母細(xì)胞卵裂率僅為７５．３８％，桑葚胚率為６４．６２％；當(dāng)脈沖時(shí)程達(dá)到４０和８０ μｓ時(shí)，其卵裂率分別是８４．６２％和７７．１７％；當(dāng)達(dá)到１００ μｓ時(shí)，豬卵母細(xì)胞的卵裂率和桑葚胚率都明顯下降，分別為６５．０６％和６０．００％。由此可見，脈沖時(shí)程過長(zhǎng)會(huì)影響豬卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。

２．３不同電脈沖次數(shù)對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌激活的影響

在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，電場(chǎng)時(shí)程為６０ μｓ的條件下，由表３可見，２DC激活豬卵母細(xì)胞的卵裂率（８７．５０％）、桑葚胚率（８１．２５％）和１DC的卵裂率（８８．６８％）、桑葚胚率（８1．１３％）之間無顯著差異（Ｐ＞０．０５），但兩者均顯著高于３DC的卵裂率（７２．５０％）和桑葚胚率（70．27％）。

２．４ＥＳ＋ＣＢ、ＥS＋ＣＨＸ、ＥＳ＋6-ＤＭＡＰ、ＥＳ＋ＣＢ＋ＣＨＸ、ＥＳ＋ＣＢ＋6-ＤＭＡＰ處理對(duì)豬卵母細(xì)胞激活的影響

由表４可見，豬成熟卵母細(xì)胞經(jīng)電刺激（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，ＥＳ）后，分別用ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）、ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）各自處理４ ｈ。結(jié)果表明，ＥＳ＋ＣＢ＋ＣＨＸ和ＥＳ＋ＣＢ＋6-ＤＭＡＰ組卵裂率顯著高于其他３組，但其桑葚胚率沒有顯著差異，以ＥＳ＋ＣＢ＋ＣＨＸ組效果略好于其他組。

３討論

體外成熟豬卵母細(xì)胞在電場(chǎng)時(shí)程６０ μｓ，１ＤＣ的條件下，電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ｋＶ/ｃｍ 時(shí)，卵母細(xì)胞的卵裂率為８８．６８％，桑葚胚率為８1．１３％，較其他各組高，當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)繼續(xù)增大時(shí)，其卵裂率和桑葚胚率均下降。表明在一定場(chǎng)強(qiáng)范圍內(nèi)，隨著場(chǎng)強(qiáng)的增加，激活豬卵母細(xì)胞的分裂率也相應(yīng)增加，但電場(chǎng)強(qiáng)度過高則會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞受到損傷，死亡率也相應(yīng)增多，此結(jié)果與譚景和等［７］和陳乃清等［８］的研究結(jié)果一致。對(duì)各組進(jìn)行比較，在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，６０ μｓ，１ＤＣ的電刺激可以對(duì)體外成熟的豬卵母細(xì)胞取得較好的激活效果。

在當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，１DC的條件下，脈沖時(shí)程２０ μｓ時(shí)，豬卵母細(xì)胞卵裂率僅為７５．３８％，桑葚胚率為６４．６２％；當(dāng)脈沖時(shí)程達(dá)到４０和８０ μｓ時(shí)，其卵裂率分別為８４．６２％和７７．１７％；當(dāng)達(dá)到１００ μｓ時(shí)，豬卵母細(xì)胞的卵裂率和桑葚胚率都明顯下降，分別為６５．０６％和６０．００％。由此可見，脈沖時(shí)程過長(zhǎng)，會(huì)影響豬卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。

在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，電場(chǎng)時(shí)程為６０ μｓ的條件下，２DC激活豬卵母細(xì)胞的卵裂率（８７．５０％）、桑葚胚率（８１．２５％）和１DC的卵裂率（８８．６８％）、桑葚胚率（８1．１３％）之間無顯著差異（Ｐ﹥０．０５），但兩者均顯著高于３DC的卵裂率（７２．５０％）和桑葚胚率（70．27％）。表明１次或２次電脈沖就足以激活豬卵母細(xì)胞，過高脈沖對(duì)細(xì)胞反而有傷害作用。

Ｌyon等［９］報(bào)道，一次脈沖只能引起卵子中Ｃａ２＋濃度一次升高，多次脈沖可誘導(dǎo)卵子中Ｃａ２＋濃度多次升高。本研究在電場(chǎng)強(qiáng)度為１．６ ｋＶ／ｃｍ，電場(chǎng)時(shí)程為６０ μｓ的情況下，２DC激活豬卵母細(xì)胞的卵裂率、桑葚胚率和１DC的卵裂率、桑葚胚率無顯著差異（Ｐ＞０．０５），但兩者均顯著高于３DC的卵裂率（７２．５０％）和桑葚胚率（70．27％）。在電脈沖作用下，卵母細(xì)胞的細(xì)胞膜會(huì)形成很多可恢復(fù)的微孔，使細(xì)胞外介質(zhì)中的Ｃａ２＋進(jìn)入細(xì)胞，使胞內(nèi)Ｃａ２＋濃度升高，從而激活卵母細(xì)胞。多次電刺激可誘導(dǎo)卵母細(xì)胞中Ｃａ２＋濃度多次升高［１０］。但對(duì)豬卵母細(xì)胞激活而言，越來越多的研究表明，隨著脈沖次數(shù)增多，卵母細(xì)胞激活率并不顯著升高，并且隨著脈沖次數(shù)增加，卵母細(xì)胞裂解率也增加［２］。本試驗(yàn)中使用１次脈沖和２次脈沖均取得了較好效果。

豬成熟卵母細(xì)胞經(jīng)電激活（１．６ ｋＶ／ｃｍ，６０ μｓ，１ＤＣ）后，分別用ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）、ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋ＣＨＸ（１０ μｇ／ｍＬ）、ＣＢ（７．５ μｇ／ｍＬ）＋6-ＤＭＡＰ（２ ｍｍｏｌ／Ｌ）各自處理４ ｈ。ＥＳ＋ＣＢ＋ＣＨＸ和ＥＳ＋ＣＢ＋6-ＤＭＡＰ組卵裂率顯著高于其他３組，但其桑葚胚率沒有顯著差異，以ＥＳ＋ＣＢ＋ＣＨＸ組效果最好。在孤雌激活研究中，一般采用單純電刺激激活的卵母細(xì)胞孤雌胚大多為單倍體，影響其發(fā)育［１１］。因此，為了提高孤雌激活胚胎的發(fā)育率，常常將電刺激與化學(xué)激活聯(lián)合起來進(jìn)行激活［１２］。Ｗａｋａｙａｍａ等［１３］研究發(fā)現(xiàn)電激活后再用化學(xué)激活能顯著提高克隆胚的發(fā)育。試驗(yàn)結(jié)果表明，電激活和化學(xué)激活聯(lián)合激活卵母細(xì)胞的激活率高于單純電刺激激活的激活率。究其原因可能激活率會(huì)隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的升高而升高，但是其卵裂解率也呈上升趨勢(shì)。在適當(dāng)?shù)碾娂せ詈?，再用離子霉素處理有可能彌補(bǔ)細(xì)胞內(nèi)Ｃａ２＋濃度不夠和用高的電場(chǎng)強(qiáng)度造成的損害，使其激活率高于單純電激活的激活率。

參考文獻(xiàn)：

［１］ ＢＥＴＴＨＡＵＳＥＲ Ｊ， ＦＯＲＳＢＥＲＧ Ｅ， ＡＵＧＥＮＳＴＥＩＮ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｆｒｏｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０００， １８（１０）：１０５５－１０５９．

［２］ ＯＮＩＳＨＩ Ａ， ＩＷＡＭＯＴＯ Ｍ， ＡＫＩＴＡ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｐｉｇ ｃｌｏｎｉｎｇ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｎｕｃｌｅｉ［Ｊ］． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８９（５４８２）：１１８８－１１９０．

［３］ ＰＯＬＥＪＡＥＶＡ Ｉ Ａ， ＣＨＥＮ Ｓ Ｈ， ＶＡＵＧＨＴ Ｔ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｅｄ ｐｉｇｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７（６８００）：８６－９０．

［４］ ＭＡＵ Ｊ Ｃ， ＧＲＵＰＥＮ Ｃ Ｇ， ＶＥＲＭＡ Ｐ Ｊ， ｅｔ ａｌ． ＭＰＦ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ６－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ［Ｊ］． Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ， ２００１，５５（１）：４５７．

［５］ ＴＡＯ Ｔ， ＭＡＣＨ?魣ＴＹ Ｚ， ＡＢＥＹＤＥＥＲＡ Ｌ Ｒ， ｅｔ ａｌ． Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ［Ｊ］． Ｚｙｇｏｔｅ，２０００，８（１）：６９－７７．

［６］ ＮＵＳＳＢＡＵＭ Ｄ Ｊ， ＰＲＡＴＨＥＲ Ｒ Ｓ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，１９９５，４１（１）：７０－７５．

［７］ 譚景和，周琪． 卵齡和脈沖持續(xù)時(shí)間對(duì)小鼠卵母細(xì)胞電活化效果的影響［Ｊ］．動(dòng)物學(xué)報(bào)， １９９５，４１（３）：３２７－３３１．

［８］ 陳乃清，趙浩斌，茍德明，等． 豬胚胎細(xì)胞核移植［Ｊ］．西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，１９９６，２４（６）：１－５．

［９］ ＬＹＯＮ Ｍ Ｋ ，ＬＥＡＬ Ｌ Ｇ． Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｈａｎｎｅｌ ｆｌｏｗ ［Ｊ］． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ，１９９８，３６３：２５－５６．

［１０］ ＳＵＮ Ｆ Ｚ， ＨＯＹＬＡＮＤ Ｊ， ＨＵＡＮＧ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｇｇｓ ａｆｔｅｒ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ［Ｊ］． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９２，１１５（４）：９４７－９５６．

［１１］ ＬＯＩ Ｐ，ＬＥＤＤＡ Ｓ，ＦＵＬＫＡ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｏｖｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｓ： ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ， １９９８，５８（５）：１１７７－１１８７．

［１２］ ＺＨＵ Ｊ， ＴＥＬＦＥＲ Ｅ Ｅ， ＦＬＥＴＣＨＥＲ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｐｏｒｃｉｎｅ ｏｏｃｙｔｅｓ ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ，２００２，６６（３）：６３５－６４１．

［１３］ ＷＡＫＡＹＡＭＡ Ｔ， ＰＥＲＲＹ Ａ Ｃ Ｆ， ＺＵＣＣＯＴＴＩ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｆｕｌｌ－ｔｅｒｍ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｍｉｃｅ ｆｒｏｍ ｅｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｏｏｃｙｔｅｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｉ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９８， ３９４（6691）：３６９－３７４．