馬鈴薯Y病毒廣東分離物HC-Pro基因的克隆和序列分析

摘要：利用ＲＴ－ＰＣＲ法對廣東煙草樣品的馬鈴薯Ｙ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ，ＰＶＹ）輔助成分蛋白質（Ｈｅｌｐｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＨＣ－Ｐｒｏ）基因進行了克隆，并對其進行了序列分析。測序結果表明廣東ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ（命名為ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ）基因（用ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ表示）全長１ ３９５ ｂｐ，編碼４６５個氨基酸。與已報道的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因核苷酸序列相比發現，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ與ＰＶＹ ＮＴＮ株系（ＰＶＹＮＴＮ）（ＡＢ３３１５１７）的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因核苷酸序列相似性最高，達９９．６％。而氨基酸序列比較表明，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ與ＰＶＹ Ｎ株系（ＰＶＹＮ）（ＡＭ２６８４３５）的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ氨基酸序列相似性最高，為９９．１％。進一步將ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的核苷酸和其編碼的氨基酸序列與其他報道的同源基因比對構建了系統關系樹，結果顯示廣東煙草樣品中ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ與ＰＶＹＮＴＮ ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ親緣關系最近。

關鍵詞：馬鈴薯Ｙ病毒；廣東煙草樣品；ＨＣ－Ｐｒｏ基因；克隆；序列分析

中圖分類號：Ｓ５３２；Ｓ４３２．４＋１ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）20－4298-04

Cloning and Sequence Analysis of HC-Pro of PVY-GD Isolate

ＧＵＯ Ｘｉａｏ－ｊｉａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｏｎｇｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｈｅｌｐｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＨＣ－Ｐｒｏ） ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ（ＰＶＹ） ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＨＣ－Ｐｒｏ ｏｆ ＰＶＹ ｆｒｏｍ ｔｏｂａｃｃｏ ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ（ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ） ｗａｓ １ ３９５ ｂｐ， ｅｎｃｏｄｉｎｇ ４６５ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ ｓｈａｒｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ ｓｔｒａｉｎ ＮＴＮ （ＡＢ３３１５１７） （９９．６％）， ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ ｓｔｒａｉｎ Ｎ （ＡＭ２６８４３５） （９９．１％）． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ ａｎｄ １７ ｏｔｈｅｒ ＰＶＹ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ ｈａｄ ｔｈｅ ｃｌｏｓｅｓｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗｉｔｈ Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ ｓｔｒａｉｎ ＮＴＮ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ； tobacco leaves in Guangdong； ＨＣ－Ｐｒｏ ｇｅｎｅ； ｃｌｏｎｅ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ

馬鈴薯Ｙ病毒（Ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ Ｙ，ＰＶＹ）是植物病毒最大屬馬鈴薯Ｙ病毒屬（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）的典型成員。Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ成員還與其他病毒間有協生作用，它通常作為激發病毒促進另一種異源病毒的復制，而其復制水平不變或稍有降低，如ＰＶＹ就和馬鈴薯Ｘ病毒（ＰＶＸ）之間存在協生作用，研究發現ＰＶＹ促進ＰＶＸ的侵染，使ＰＶＸ的危害加重，而ＰＶＸ對ＰＶＹ則無影響，即ＰＶＹ介導ＰＶＹ／ＰＶＸ的協生作用［１－４］，病毒間的協生作用加劇了農作物病毒病的危害，造成了巨大的經濟損失。目前ＰＶＹ在全球范圍內已成為馬鈴薯、煙草和辣椒等茄科作物病毒病的主要病源之一，并且在中國范圍內煙草遭受ＰＶＹ危害呈逐年上升趨勢。

根據ＰＶＹ的鑒別寄主反應、血清學反應和引起的癥狀類型將其分為多個株系，常見馬鈴薯Ｙ病毒Ｏ株系（ＰＶＹＯ）、馬鈴薯Ｙ病毒Ｎ株系（ＰＶＹＮ）和馬鈴薯Ｙ病毒Ｃ株系（ＰＶＹＣ）三種株系。另外又有兩種株系，如馬鈴薯Ｙ病毒ＮＴＮ株系（ＰＶＹＮＴＮ）最早于20世紀80年代在匈牙利被發現［５］，其與ＰＶＹＮ具有血清學關系，在煙草上引起葉脈壞死［６，７］。馬鈴薯Ｙ病毒Ｎ：Ｏ株系（ＰＶＹＮ：Ｏ）在煙草上引起類似于ＰＶＹＮ的葉脈壞死癥狀，但血清學鑒定發現它與ＰＶＹＮ沒有血清學關系，而與ＰＶＹＯ具有血清學關系［８，９］。

ＰＶＹ由單一的外殼蛋白和一條正鏈ＲＮＡ組成，整個病毒基因組只有一個閱讀框，翻譯產生一個巨大的多聚前體蛋白質，通過加工裂解成不同功能的成熟蛋白質，隨著對ＰＶＹ分子生物學研究的深入，對不同蛋白質也有一定的了解，其中輔助成分蛋白（Ｈｅｌｐｅｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＨＣ－Ｐｒｏ）是一種７５ｋＤ的多肽，為一種多功能的蛋白質［１０］。它的Ｎ端控制蚜蟲傳播和病毒的復制；Ｃ端是一種半胱氨酸類型的蛋白酶，具有蛋白酶活性，以順式方式催化自身的斷裂［１１］，中心區域參與病毒細胞間和長距離運輸，也是介導病毒協生作用的功能區，在協生作用中起主導作用［１２］，近期發現ＨＣ－Ｐｒｏ還可以作為病毒轉錄后基因沉默（ＰＴＧＳ）的抑制子［１３，１４］。

通過ＲＴ－ＰＣＲ技術從廣東煙草上克?。校郑?ＨＣ－Ｐｒｏ（命名為ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ）基因（用ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ表示），并進行ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的序列分析，對進一步研究ＰＶＹ株系種類、蚜蟲傳毒機制、ＰＶＹ與寄主互作機制以及病害流行學具有重要的意義。同時，也為利用基因工程技術進行抗病毒育種來防治ＰＶＹ的危害提供了理論基礎。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１病樣采集２００８年５月從廣東省南雄市煙田采集葉片呈現葉脈壞死癥狀的煙草，病葉保存于－８０ ℃冰箱備用。

１．１．２菌種及載體轉化受體大腸桿菌ＤＨ５α由仲愷農業工程學院生物科學實驗室制備，克隆載體ｐＭＤ１８－Ｔ購自寶生物工程（大連）有限公司（ＴａＫａＲａ公司）。

１．１．３酶與試劑Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶等工具酶購自鼎國生物有限公司，逆轉錄試劑盒購自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司，瓊脂糖凝膠ＤＮＡ純化回收試劑盒購自Ｐｒｏｍｅｇａ公司。

１．２方法

１．２．１植物總ＲＮＡ的提取采用Ｔｒｉｚｏｌ方法提取煙草總ＲＮＡ。

１．２．２引物的設計與合成從ＮＣＢＩ的ＧｅｎＢａｎｋ上下載ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ序列，根據ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ兩側的保守序列設計一對特異性引物ＨＣ／Ｆ和ＨＣ／Ｒ。引物序列如下，ＨＣ／Ｆ：５′－ＧＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴ-

ＣＴＡＴ－３′，ＨＣ／Ｒ：５′－ＴＡＡＡＡＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＧＡＣＣＣＡ－３′，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

１．２．３ｃＤＮＡ的合成及ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的ＰＣＲ擴增用Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ的逆轉錄試劑盒在Ｍ－ＭｕＬＶ逆轉錄酶作用下合成ｃＤＮＡ第一鏈，具體方法參照Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ的逆轉錄試劑盒的操作說明。ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ用ＨＣ／Ｆ和ＨＣ／Ｒ進行ＰＣＲ擴增。

１．２．４ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的克隆對ＰＣＲ產物進行０．８％瓊脂糖凝膠電泳，用ＤＮＡ純化回收試劑盒回收目的片段，然后與載體ｐＭＤ１８－Ｔ連接，再轉化大腸桿菌ＤＨ５α，最后篩選陽性克隆。

１．２．５序列測定和分析陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序，再利用ＤＮＡＳｔａｒ軟件Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｖ進行序列相似性比較。進化樹構建利用ＤＮＡＭＡＮ軟件進行。用于序列分析的PVY ＨＣ－Ｐｒｏ來源株系（登錄號）為：ＰＶＹＣ（ＡＪ８９０３４８）；ＰＶＹＮ：Ｏ（ＡＹ７４５４９１和ＡＹ７４５４９２）；ＰＶＹＮ（ＡＪ５８５１９７、ＡＭ２６８４３５、ＥＵ１８２５７６

和Ｘ９７８９５）；ＰＶＹＮＴＮ（ＡＢ３３１５１７、ＡＢ３３１５１９、ＡＪ８８９８６６、

ＡＪ８９０３４３、ＡＪ８９０３４６、ＦＪ２０４１６４和ＦＪ２０４１６６）；ＰＶＹＯ（ＡＪ５８５１９６、ＡＹ５４７３２４和ＥＦ０２６０７４）。

２結果與分析

２．１ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的克隆

以逆轉錄的ｃＤＮＡ第一鏈為模板，用引物進行ＰＣＲ擴增，ＰＣＲ產物進行０．８％瓊脂糖凝膠電泳，可見一條約１ ５００ｂｐ的特異性擴增帶（圖１）。ＰＣＲ產物純化后，與載體ｐＭＤ１８－Ｔ連接，轉化大腸桿菌ＤＨ５α，菌落ＰＣＲ篩選出陽性克隆。

２．２序列比較及分子進化分析

利用上海生工生物工程技術服務有限公司的ＤＮＡ熒光自動序列分析儀測定陽性克隆全長為１ ４９０ ｂｐ。截去ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ兩側序列，研究從廣東煙草上克隆到的ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ核苷酸序列全長１ ３９５ bp，共編碼４６５個氨基酸（ＧｅｎＢａｎｋ序列登錄號：ＦＲ６９４６７５）。利用ＤＮＡＳｔａｒ軟件對ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ序列與其他１７個ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因核苷酸序列以及各自編碼的氨基酸序列相比較，結果見表１。比較結果表明，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的核苷酸序列與ＰＶＹＯ和ＰＶＹＣ株系的相似性小于其余的株系，其中與ＰＶＹＮＴＮ（ＡＢ３３１５１７）的相似性最高，達９９．６％，而與ＰＶＹＯ（ＡＪ５８５１９６）的相似性最低，僅為７９．６％；ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ編碼的氨基酸序列則與ＰＶＹＮ（ＡＭ２６８４３５）的相似性最高為９９．１％，與ＰＶＹＯ（ＡＪ５８５１９６）的相似性最低為８９．０％。

利用ＤＮＡＭＡＮ軟件構建ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ與其他ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因的核苷酸和編碼的氨基酸序列系統進化樹也可以看出，從廣東煙草上克隆的ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ與ＰＶＹＮＴＮ的PVY HC-Pro的親緣關系最近（圖２）。

３討論

通過ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了廣東煙草ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ，并對其進行了序列分析，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ全長

１ ３９５ ｂｐ，編碼４６５個氨基酸，與文獻報道的１７個ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因序列比較表明，ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ的核苷酸序列與ＰＶＹＮＴＮ（ＡＢ３３１５１７）的相似性最高，達到９９．６％，其編碼的氨基酸序列與ＰＶＹＮ（ＡＭ２６８４３５）相似性最高，達到９９．１％。

從株系間親緣關系的角度分析，由ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ和選取的其他１７個PVY HC-Pro基因核苷酸序列和編碼的氨基酸序列構建的系統進化樹的分析可知，無論是以基因的核苷酸序列還是編碼氨基酸序列的構建系統進化樹的結果，所有的１８個ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ聚成兩個分支，其中ＰＶＹＣ和ＰＶＹＯ兩株系形成一個分支，而ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ與已報道的多個ＰＶＹＮＴＮ、ＰＶＹＮ和ＰＶＹＮ：Ｏ的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ聚為一類，形成另外一個分支，其中研究所得到的ＰＶＹ－ＨＣ－ＧＤ與ＰＶＹＮＴＮ的ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ有最近的親緣關系。

由于ＰＶＹ不同株系發生混合侵染及不斷有新的ＰＶＹ株系和亞株系被發現，ＰＶＹ株系的鑒定變得越來越復雜［１５，１６］。常用的鑒定方法有生物學鑒定、血清學鑒定及分子鑒定。ＰＶＹＮ和ＰＶＹＮＴＮ兩個株系無法用血清學區分［１７］，通過分子鑒定發現ＰＶＹＮ：Ｏ是由ＰＶＹＯ和ＰＶＹＮＴＮ重組形成［８，１８］，這都說明ＰＶＹＮＴＮ、ＰＶＹＮ和ＰＶＹＮ：Ｏ三個株系有高度的同源性。目前研究者們將ＰＶＹＮＴＮ和ＰＶＹＮ：Ｏ歸屬為ＰＶＹＮ的兩個亞株系。研究中ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因序列相似性比較和系統關系樹分析也進一步說明ＰＶＹＮＴＮ、ＰＶＹＮ與ＰＶＹＮ：Ｏ株系之間差異性很小，ＰＶＹ ＨＣ－Ｐｒｏ基因是否可以作為ＰＶＹ株系劃分的依據還有待于進一步研究。

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