應用ISSR-PCR對10個菊花品種進行遺傳多樣性分析

摘要：中國的菊花（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｒａｍａｔ．）品種數量眾多，形態變異豐富，適應性強，分布廣泛，遺傳背景非常復雜，這為菊花品種的資源調查、分類鑒定、遺傳多樣性分析等帶來了困難。試驗采用分子標記技術，對福白菊（Ｃ． ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ． Ｆｕｂａｉｊｕ）、杭白菊（Ｃ． ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ． Ｈａｎｇｂａｉｊｕ）等１０個菊花品種進行了分類鑒定及親緣關系研究，結果顯示，在簡單序列重復區間擴增－聚合酶鏈式反應 （Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ－ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ＩＳＳＲ－ＰＣＲ） 分子標記反應體系及引物的篩選方面，選擇了條帶數量多和清晰度高的菊花反應體系，應用野生福白菊對３９條ＩＳＳＲ引物進行了篩選，淘汰了擴增效果差、帶型不易辨認的引物，最終確定１２條引物用于菊花品種的鑒定。ＩＳＳＲ-PCR聚類分析結果表明，１２條ＩＳＳＲ引物擴增出了１８５條清晰的、重復性好的ＩＳＳＲ條帶，其中多態性條帶有１７６條，多態性比率高達９５．１％。應用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ軟件進行ＵＰＧＭＡ法聚類分析，在相似系數０．５５處可將１０個菊花品種大致分為3類，結果福白菊與其他杭菊品種在遺傳上有較大的差異。

關鍵詞：菊花；簡單序列重復區間擴增－聚合酶鏈式反應；分子標記；遺傳多樣性

中圖分類號：Ｓ６８２．１＋１；Ｑ５０３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）20－4292-06

Genetic Diversity Analysis of Ten Chrysanthemum morifolium Cultivars Using

ISSR-PCR

ＣＨＥＮＧ Ｈｕａ１，２，ＬＩ Ｌｉｎ－ｌｉｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｘｉｎ－ｌｉｎｇ３，ＦＡＮＧ Ｊｉａ２，ＺＨＥＮＧ Ｙｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ３，ＪＩＡＮＧ Ｄｅ－ｚｈｉ１，２，

ＣＨＥＮＧ Ｓｈｕｉ-ｙｕａｎ１，２

（１． Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｆｏｒｅｓｔ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈｕａｎｇｇａｎｇ ４３８０００， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ；

３． Ｔｈｅ Fubaiju Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｃｈｅｎｇ Ｃｉｔｙ， Ｍａｃｈｅｎｇ ４３８３３１， Ｈｕｂｅｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｒａｍａｔ． ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ due ta ｉｔｓ ｎｕｍｅｒｏｕｓ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ， ａｂｕｎｄａｎｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ， ｐｏｗｅｒｆｕｌ ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ， ｗｉｄｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ． Tｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ １０ Ｃ． ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ． Ｔｈｅ ｍａｉｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ． Ｔｈｅ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｗｉｔｈ ｍｏｒｅ ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＩＳＳＲ－ＰＣＲ （Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ－ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ） ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ． １２ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ. ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ＩＳＳＲ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ that １８５ ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ＩＳＳＲ-PCR ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ １２ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ， １７６ ｂａｎｄｓ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｒａｔｅｓ ｕｐ ｔｏ ９５．１％． １０ Ｃ． ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ＵＰＧＭＡ ｃｌｕｓｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ０．５５， ｂｙ ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｌａｒｇｅ ｈｅｒｅｄｉｔｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃ． ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ． Ｆｕｂａｉｊｕ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｏｆ Ｃ. ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｒａｍａｔ．； Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ－Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＩＳＳＲ－ＰＣＲ）； ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｃｅｒ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ

菊花（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ Ｒａｍａｔ．）為菊科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）菊屬（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ Ｌ．）草本植物，是經長期人工選擇培育出的名貴觀賞花卉。品種極為豐富，菊科是種子植物中的最大科，總數約２５ ０００～３０ ０００種［１］。菊花是中國的傳統名花，觀賞價值高，同時又是傳統的中藥材和保健茶飲，有疏風清熱、平肝明目、去火解毒之功效，臨床上用于治療頭痛、眩暈、目赤、心胸煩熱、疔瘡、腫毒等癥［２］?，F代藥理研究表明，菊花具有治療冠心病、高血壓、預防高血脂、抗菌、抗病毒、抗衰老等多種藥理功效。

中國的藥用菊花栽培歷史悠久，分布廣泛，類型多樣。由于長期人工引種栽培、異花授粉及人工選擇，其遺傳背景非常復雜。麻城福田河菊花自北宋時就有人工種植，至今已有近千年歷史。近年來隨著種植、加工、經營水平的全面提高，福白菊（Ｃ． ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ． Ｆｕｂａｉｊｕ）品種迅速得到了市場的廣泛認同。然而，由于長期以來福白菊沒有自身品牌，質量優良的福白菊大多被浙江、廣東等地的藥商收購走，換成杭白菊（Ｃ． ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ｃｖ． Ｈａｎｇｂａｉｊｕ）商標后大批銷往國內外，并且目前尚無關于福白菊和杭白菊植物學性狀及遺傳背景差異的系統性研究。因此，造成了福白菊與杭白菊認知混亂的現狀，不僅不利于福白菊資源優勢的充分利用，而且亦不利于福白菊品牌建設和福白菊產業的持續性發展。

簡單序列重復區間（Ｉｎｔｅｒ－ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ，ＩＳＳＲ）技術是一種基于聚合酶鏈式反應（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）的分子標記技術，ＩＳＳＲ－ＰＣＲ結合了擴增片段長度多態性分析（Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）、簡單序列重復標記（Ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ，ＳＳＲ）、隨機擴增多態性ＤＮＡ標記（Ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ，ＲＡＰＤ）等標記技術的優點［３］。同時，由于采用了較長的引物，使得試驗結果的可重復性大大提高。目前，ＩＳＳＲ已成功應用于多種園藝植物的品種鑒定、遺傳多樣性分析或指紋圖譜構建等方面的研究［４－７］。試驗通過ＩＳＳＲ分子標記技術對所選取的藥用菊花品種進行了遺傳多樣性分析，并構建了ＤＮＡ指紋圖譜，以期為福白菊品種保護及鑒定提供分子證據，并為菊花品種選育提供理論指導。

１材料與方法

１．１材料

供試材料為１０個菊花品種，分別取自浙江省、江蘇省菊花種植園及湖北省麻城市等地，每個品種隨機選取１０株生長健壯的植株，摘取頂部完全展開的嫩葉，混合提?。模危?。材料來源和處理編號見表１。另取麻城市當地野生的福白菊植株，總DNA樣品制作同前。主要試劑Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ和Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００購自寶生物（大連）有限公司，其他常規試劑均為國產分析純。

１．２研究方法

１．２．１總ＤＮＡ的提取與檢測采用改良的ＣＴＡＢ法提取各菊花品種葉片的總ＤＮＡ，提取液成分與魏春紅等的配方相同［８］。用電泳儀檢測總ＤＮＡ質量，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 核酸濃度測定儀檢測總ＤＮＡ濃度，并稀釋至１５ ｎｇ／μＬ。

１．２．２引物選擇根據菊花ＥＳＴ文庫，參照加拿大哥倫比亞大學網站公布的ＩＳＳＲ引物序列，設計出３９條引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；選取野生福白菊總ＤＮＡ作為模板，分別用這３９條ＩＳＳＲ引物進行篩選，從中篩選多態性較好的引物進行擴增。經過反復比較，最后選擇擴增條帶清晰、反應穩定且多態性較好的１２條引物對１０個菊花品種樣品進行擴增，各引物的編號、序列及退火溫度見表２。

１．２．３ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增程序ＰＣＲ擴增反應總體積為３０ μＬ，包括３０～７０ ｎｇ ＤＮＡ模板、２ μＬ ２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｍｇ２＋等。ＰＣＲ擴增程序為９４ ℃ 預變性４ｍｉｎ；９４ ℃ 變性３０ ｓ，退火４０ ｓ，７２ ℃ 延伸３ｍｉｎ，共３５個循環；最后７２℃ 延伸１０ ｍｉｎ。擴增結束后，將ＰＣＲ擴增產物用０．８％瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，篩選出具有條帶的擴增產物，再用６％的聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀染色、氫氧化鈉顯影，以篩選出多態性較好的引物用于菊花的品種鑒定。

１．２．４條帶統計與分析條帶的統計以其清晰可重復為基本原則，采用人工讀帶法，按照同一遷移位置ＩＳＳＲ條帶的有、無進行統計，有帶的記為１，無帶的記為０，建立二元數據矩陣，輸入計算機。利用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ軟件對菊花品種進行非加權類平均法（ＵＰＧＭＡ）聚類，構建系統聚類分析樹狀圖。具體步驟一是統計每條引物擴增出的總條帶數和其中的多態性條帶數，并計算出多態性比率；二是應用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ軟件對數據進行分析，相似系數采用Ｄｉｃｅ系數，獲得相似系數矩陣；最后用ＳＡＨＮ程序進行類平均法聚類分析，獲得聚類圖。

２結果與分析

２．１ＤＮＡ提取與質量檢測結果

對１０個菊花品種的葉片，采用改良ＣＴＡＢ法提取菊花的總ＤＮＡ，０．８％的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖１。從圖１可見，有一條明顯的亮條帶集中在點樣孔附近，濃度較高，帶型完整，可以用于下一步的ＰＣＲ擴增反應。

２．２ＩＳＳＲ引物篩選

試驗先以野生福白菊總ＤＮＡ為模板，經初篩從３９條ＩＳＳＲ引物中選擇出條帶多且明亮清晰的１２條引物用于福白菊、杭白菊等１０個菊花品種的ＩＳＳＲ分析，結果見圖２。

２．３菊花ＩＳＳＲ－ＰＣＲ擴增結果的多態性分析

菊花品種采用的ＩＳＳＲ引物及其擴增結果見表３，經統計，１２條引物對１０個菊花品種的ＩＳＳＲ－ＰＣＲ共檢測到１８５條擴增條帶，其中多態性條帶１７６條，多態性比率為９５．１％，不同引物擴增的條帶數介于７～２３條之間，平均每個引物擴增的條帶數為１５．４條。除引物ＳＳＲ１６、ＳＳＲ１７、ＳＳＲ３１外，其他引物的多態性比率均在９４．１％以上，引物ＳＳＲ９、ＳＳＲ１０、ＳＳＲ２７、ＳＳＲ３２、ＳＳＲ３４、ＳＳＲ３６的多態性比率均為１００％。

應用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ軟件，以１０個菊花品種和１８５條擴增條帶數據為原始矩陣，共獲得４５個兩兩不同品種間的Ｄｉｃｅ相似系數，具體見表４。從表４可見，相似系數在０．５０８ １０～０．９１３ ５１之間，表明ＩＳＳＲ分子標記具有較強的多態性，可在分子水平上顯示出這１０個品種間的差異。圖３、圖４、圖５、圖６、圖７、圖８、圖９、圖１０、圖１１、圖１２、圖１３、圖１４分別為篩選出的１２條引物對福白菊、杭白菊等１０個菊花品種（Ａ～Ｊ）的總ＤＮＡ進行的ＩＳＳＲ擴增圖譜。

２．４ＩＳＳＲ-PCR聚類分析

應用ＮＴＳＹＳ ２．１０ｅ軟件，以１０個菊花品種和１７６條擴增條帶數據為原始矩陣，在獲得了兩兩不同品種間的Ｄｉｃｅ相似系數的基礎上，用ＵＰＧＭＡ法對１０個菊花品種進行聚類分析，聚類結果見圖１５。由圖１５可以看出，菊花品種間遺傳相似系數越高，其親緣關系就越近，品種間的差異就越??；反之則越大。在相似系數０．５４處，１０個品種可分成兩支，射陽黃花和黃山貢菊黃花聚成一支，兩品種的相似系數為０．５７，其余８個品種聚成第二支。在相似系數處０．５５處，迷你小酒菊與另外７個品種產生分支。在相似系數０．６６處，剩余７個品種分為兩小支，第一小支只有福白菊一個品種；第二小支在相似系數０．７１處又可分為兩組，第一組包括杭白菊、射陽大白菊，第二組包括杭黃菊、杭小洋菊、金菊１號、金菊２號，且第二組４個品種兩兩間的相似系數高達０．８８以上，品種之間的遺傳關系很近。

總體上來說，這１０個菊花品種可大致分成三大類，第一類為射陽黃花、黃山貢菊黃花；第二類為迷你小酒菊；其余７個品種為第三類。第三類７個品種中，杭白菊、射陽大白菊、杭黃菊、杭小洋菊、金菊１號、金菊２號聚成一亞類，只有福白菊單獨聚成一亞類。并且在相似系數０．５６（0.55~0.57，取中值）處，射陽黃花、黃山貢菊黃花、迷你小酒菊都未能與其他品種聚類，表明它們與其他品種的遺傳差異較大。

３討論

ＩＳＳＲ分子技術具有多態性高、重復性好、操作簡便、費用低等優勢，已廣泛用于菊花的品種鑒定與分類、親緣關系確認與遺傳多樣性分析等研究領域［７，９］。試驗采用ＩＳＳＲ-PCR技術研究福白菊、杭白菊等１０個菊花品種，得到了它們之間的相似系數，構建了遺傳關系樹狀圖，這個結果表明，利用ＩＳＳＲ-PCR技術可以有效地區分福白菊與其他菊花品種的遺傳差異，這在分子水平上為福白菊的品牌建設提供了有說服力的佐證。

前人通過對藥用菊花的本草考證認為，茶菊發源于浙江省，原產于杭州市余杭區的白茶菊在逐漸北移至桐鄉市后，形成了現在的杭白菊；原產于德清市的德菊被引入安徽省歙縣后形成貢菊。江蘇省射陽縣產的藥用菊花主要引種于杭菊，而福白菊則是由杭白菊引種到湖北省麻城市福田河地區后形成的當地一個特色品種［１０］。試驗中地域來源與聚類結果表現出了一定的相關性，產于浙江省桐鄉市的杭白菊、杭黃菊、杭小洋菊、金菊１號、金菊２號聚為了一類，均為杭菊品系；除杭白菊外，其余品種兩兩間的相似系數高達０．８８以上，說明品種間的親緣關系非常接近。福白菊為產于湖北省麻城市的菊花，與杭菊品種聚為一類，這與福白菊引種于杭菊相關，但相似系數并不高，僅為０．６６。當然也存在例外，如迷你小酒菊屬于杭菊栽培品種，但與其他杭菊品種間的相似系數均在０．５６以下。產于江蘇省射陽縣的射陽大白菊和射陽黃花并未聚成一類；而射陽大白菊與產于浙江省桐鄉市的杭白菊聚為一類，這在一定程度上反映了射陽大白菊與浙江省所產杭菊的親緣關系遠近。這個結果與呂琳等［６］、徐文斌等［１１］、邵清松等［１２］的研究結果較為一致。

試驗結果表明，利用ＩＳＳＲ－ＰＣＲ技術可以有效地區分福白菊與其他菊花品種間的差異，可為福白菊與杭白菊認知混亂的狀況提供分子水平上區分的佐證。為福白菊在藥用植物市場上建立品牌和產業的可持續發展提供了支撐，并為菊花品種的選育提供了理論指導。

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［１１］ 徐文斌，郭巧生， 王長林． 藥用菊花遺傳多樣性的 ＲＡＰＤ 分析［Ｊ］． 中國中藥雜志，２００６，３１（１）：１８－２１．

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