響應面法優化的水飛薊子可溶性蛋白提取工藝

摘要：采用單因素試驗研究了提取液ｐＨ、溫度、液固比和浸提時間對水飛薊子脫脂粉末可溶性蛋白質提取率的影響。根據單因素試驗結果，應用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ中心組合試驗設計原理，選取提取液ｐＨ（７．０、８．０和９．０）、溫度（３０、４０和５０ ℃）、液固比（４０∶１、５０∶１和６０∶１，V/m，ｍＬ∶ｇ）和浸提時間（９０、１２０和１５０ ｍｉｎ）４個因素為自變量，以水飛薊子脫脂粉末可溶性蛋白提取率為響應值，建立回歸模型，該模型相關系數Ｒ為０．８４３ ２。響應面法優化提取工藝，得到的最佳提取條件為提取液ｐＨ 9.0，溫度５０ ℃，液固比６０∶１，浸提時間９０ ｍｉｎ。在此條件下，水飛薊子脫脂粉末可溶性蛋白質提取率達到最大預測值５７．１０％。方差分析表明，提取液ｐＨ、溫度和液固比對蛋白質提取率有顯著影響，而提取時間的影響不顯著。驗證試驗進一步證實了模型和試驗結果的可靠性。

關鍵詞：水飛薊子；可溶性蛋白質；提取工藝；響應面法；優化

中圖分類號：Q949.783.5；Q946.1；R284.2 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）20－4250-03

Optimization of Soluble Protein Extraction from Milk Thistle （Silybum marianum） Seed by Response Surface Methodology

ＬＩＵ Ｈｅ－ｓｈｅｎｇ，ＨＵ Ｒｕｉ－ｂｉｎ，ＱＩ Ｘｉａｎｇ－ｙａｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｗａｎｌｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｉｎｇｂｏ ３１５１００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｅｆａｔｔｅｄ ｍｉｌｋ ｔｈｉｓｔｌｅ ［Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ（Ｌ．）］ ｓｅｅｄ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｕｓｉｎｇ ｐＨ （７．０， ８．０ ａｎｄ ９．０）， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ （３０， ４０ ａｎｄ ５０ ℃）， ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ （４０， ５０ ａｎｄ ６０ ｍＬ／ｇ） ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ （９０， １２０ ａｎｄ １５０ ｍｉｎ） ａｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｄｅｆａｔｔｅｄ ｍｉｌｋ ｔｈｉｓｔｌｅ ｓｅｅｄ ａｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｖａｌｕｅ， ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｂｕｉｌｔ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗａｓ ８４．３２％． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ） ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｒａｆｔ， ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｐｒｏｇｎｏｓｅｄ ａｓ ５７．１０％ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｐＨ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ ８．９７， ５０ ℃， ６０ ｍＬ／ｇ ａｎｄ ９０ ｍｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ （ＡＮＯＶＡ） ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐＨ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｉｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｈａｄ ｎｏｔ． Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ ｗｅｒｅ ｅｍｐｌｏｙｅｄ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｅｄ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉｌｋ ｔｈｉｓｔｌｅ（Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ） ｓｅｅｄ； ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

水飛薊［Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎｅｒ］，又稱乳薊，為一年或兩年生菊科草本植物，原產于地中海、歐洲西南部，在歐洲和北美已有百年的種植歷史。２０世紀７０年代從德國引進后，現主要集中在我國的陜西、黑龍江、河北等地。水飛薊是一種治療各種肝病和心血管疾病的傳統藥物，其主要活性成分為黃酮類化合物——水飛薊素，廣泛應用于治療各種肝病，例如肝炎、肝硬化、肝癌等［１－３］。此外，水飛薊還可作為抗氧化劑、抗癌劑、消炎劑和毒蕈中毒解毒劑等［４－６］。

水飛薊子除了具有很高的藥用價值以外，還具有多種營養成分，如水飛薊子中含有約２９％的油脂，不飽和脂肪酸（油酸、亞油酸和亞麻酸）的比例為７１％～８０％，可用于防治高血脂、動脈粥樣硬化等心血管疾病［７－９］；水飛薊多糖可作為一種抗氧化劑，清除自由基［１０］。而水飛薊子蛋白質含量高（２０％左右），清蛋白和球蛋白所占比例約為７０％；富含多種必需氨基酸，其中賴氨酸含量高達６．７３％，超過了ＦＡＯ／ＷＨＯ規定的標準（５．５％），可與谷類食物形成互補。另外，谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量也很高，可作為一種優質的植物源蛋白質［１１，１２］。

鑒于動物蛋白質緊缺、成本高的特點，可以充分開發優質的植物蛋白質，以滿足對優質蛋白質的攝入，所以提高植物蛋白質的開發和利用率具有重要的實際價值。目前關于水飛薊子蛋白質的文獻報道較少，依據單因素試驗結果，以蛋白質提取率為響應值，應用響應面法優化水飛薊子可溶性蛋白質提取條件，確定最佳提取條件。

１材料與方法

１．１材料

1.1.1原料與試劑水飛薊［Ｓｉｌｙｂｕｍ ｍａｒｉａｎｕｍ（Ｌ．）Ｇａｅｒｔｎｅｒ］成熟種子，來源于陜西省渭南市，粉碎后，在４ ℃磁力攪拌下，使用石油醚（沸程３０～６０ ℃）脫脂２４ ｈ，抽濾后置于真空干燥箱中干燥１０ ｈ（干燥溫度３０ ℃），緊接著過５０目篩，真空包裝、密封，置于干燥器內，室溫下保存、備用。

考馬斯亮藍Ｇ－２５０（生化試劑），國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（進口分裝），Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；無水碳酸鈉基準試劑，天津市化學試劑研究所；其他試劑均為國產分析純。

１．1.２儀器與設備真空干燥箱、電子分析天平、５８０４Ｒ高速臺式冷凍離心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ＨＹＰ－Ⅱ消化爐、ＫＤＮ－２Ｃ定氮儀、７５１型可見紫外分光光度計、精密酸度計、恒溫振蕩器等。

１．2方法

１．2．１水飛薊子脫脂粉末主要成分分析［１３］粗蛋白：微量凱氏定氮法；水分：常壓干燥法；粗脂肪：索氏提取法。

１．2．２可溶性蛋白質濃度的測定考馬斯亮藍Ｇ－２５０比色法測定提取液蛋白質濃度［１４］，以牛血清白蛋白溶液做標準曲線。

１．2．３水飛薊子可溶性蛋白質的提取準確稱取一定量的水飛薊子脫脂粉末，溶于０．０５ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ為７．３的磷酸鹽緩沖溶液（Ｎａ２ＨＰＯ４－ＫＨ２ＰＯ４）中，４ ℃攪拌浸提２ ｈ，于４ ℃，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，收集上清液，運用１．2．２方法測定蛋白質濃度。

１．2．４水飛薊子可溶性蛋白質提取率的計算蛋白質提取率＝提取液中蛋白質質量／（水飛薊子脫脂粉末質量×粗蛋白質量分數）×１００％。

１．2．５單因素試驗在參閱文獻基礎上，分別考察提取液ｐＨ、溫度、浸提時間、液固比對可溶性蛋白質提取率的影響。

１．2．６響應面法（ＲＳＭ）優化提取工藝依據單因素試驗結果，以蛋白質提取率為響應值，ｐＨ、溫度、液固比和浸提時間４個因素為自變量，采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ試驗設計、響應面法優化水飛薊子可溶性蛋白質提取工藝。因素與編碼水平見表１。

２結果與分析

２．１水飛薊子脫脂粉末主要成分分析結果

水飛薊子脫脂粉末中粗蛋白、水分、粗脂肪的質量分數（ｘ±Ｓ，％）分別為２２．２５±０．５９、８．５６±０．０４、４．６４±０．４９。

２．２牛血清白蛋白標準曲線的建立

以牛血清白蛋白標準溶液（２０～１００ μｇ／ｍＬ）制作標準曲線（圖１），其回歸方程為■＝０．００５ ８ｘ＋０．０５４ ７（ｒ＝０．９９８ ２）。

２．３單因素試驗

２．３．１ｐＨ對提取率的影響如圖２所示，隨著ｐＨ從２.0增加至５.0，蛋白質提取率逐漸降低，ｐＨ為５.0時，蛋白質提取率降至最低，該值可能接近蛋白質等電點，因為在等電點附近，蛋白質容易發生等電點聚沉［１５，１６］。ｐＨ為５.0～９.0時，隨著ｐＨ增大，提取率又逐漸增大，ｐＨ從７.0增至９.0的過程中，提取率緩慢增加，ｐＨ為９.0時達到最大值，此后隨著ｐＨ的增大，提取率又下降。因此，選擇ｐＨ為８．０左右比較適宜。

２．３．２溫度對提取率的影響在４～５０ ℃范圍內，隨著溫度升高，蛋白質提取率逐漸增大，尤其是溫度從４ ℃升至２０ ℃過程中，提取率呈直線增大，２０ ℃至５０ ℃過程中，提取率緩慢增加，５０ ℃時，達到最大值，繼續升高溫度，提取率反而降低，且下降速率極快（圖３）。因此，選擇提取溫度為４０ ℃左右為宜。

２．３．３液固比對提取率的影響液固比從１０∶１增至４０∶１過程中，提取率呈直線增加，再繼續增大液固比，提取率增加趨勢變緩慢，５０∶１之后提取率趨于穩定（圖４）。考慮后續濃縮步驟及成本，選擇液固比為５０∶１左右。

２．３．４浸提時間對提取率的影響隨著浸提時間的延長，提取率逐漸增大，浸提時間從３０ ｍｉｎ增至９０ ｍｉｎ過程中，提取率呈直線增加，９０ ｍｉｎ之后，提取率增加變緩慢，１８０ ｍｉｎ與２１０ ｍｉｎ的提取率相差較小（４３．２８％增至４３．７５％）（圖５）。因此，試驗選擇浸提時間為１２０ｍｉｎ左右。

２．４響應面分析

２．４．１回歸模型的建立與顯著性分析四因素三水平的Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ中心組合設計中，共安排２９個試驗點，其中２４個為析因點，５個為中心點，試驗結果見表２，蛋白質提取率為３２．１１％～５０．７５％。應用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ７統計分析軟件對試驗數據進行回歸分析，得到水飛薊子可溶性蛋白質提取率的二次回歸方程①為：■＝－２３１．６６０ ８３＋６２．９６１ ６７Ａ－２．０６６ ０８Ｂ＋０．１７１ ７５Ｃ＋０．５３７ ０８Ｄ＋０．０２０ ２５ＡＢ＋０．０９１ ５０ＡＣ－０．０３３ ７５ＡＤ＋０．０１９ ００ＢＣ＋０．００３ ２７ＢＤ－０．０１１ ３４ＣＤ－３．７０５ ４２Ａ２＋０．００９ ５１Ｂ２－０．００１ １７Ｃ２＋０．０００ ７０Ｄ２。回歸方程①的相關系數Ｒ為０．８４３ ２，方程的相關性較好。前人研究木豆、蠶蛹、西瓜子和紅辣椒子蛋白質提取時，結果顯示Ｒ分別為0.７７４ ８，

0.８３０ ０，0.８４６ ０和0.９６７ ０［１７－２０］。對回歸方程①進行顯著性檢驗和方差分析，結果見表３。在顯著性水平α＝０．０５下，回歸模型極顯著（Ｐ＜０．０１），而失擬項不顯著（Ｐ＞０．０５），進一步驗證了模型的可靠性及試驗誤差較小。從表３可以得出，ｐＨ、ｐＨ的二次項對響應值具有極顯著性影響（Ｐ＜０．０１），溫度、液固比和液固比與浸提時間的交互作用有顯著性影響（Ｐ＜０．０５），其他因素在本試驗取值范圍內影響不顯著（Ｐ＞０．０５）。

２．４．２水飛薊子可溶性蛋白質提取率的響應面分析固定４個因素中的任意２個為零水平，利用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ７軟件作出另外２個因素的交互作用對蛋白質提取率影響的三維響應面圖，結果見圖６～１１。從圖６～８中可以得出，ｐＨ對提取率的影響非常大，曲面較陡。隨著ｐＨ的增大，可溶性蛋白質提取率快速升高，可能與ｐＨ增大破壞了蛋白質分子間的氫鍵和使氫離子從酚類、硫酸基團中游離出來有關；ｐＨ增大，蛋白質分子的靜電荷增加，分子間斥力增大，從而有利于蛋白質的溶出［２１］。隨著溫度的升高，提取率也增大（見圖６、圖９、圖１０），可能與溫度升高物料內部分子動能增加，蛋白質分子與其他分子的作用力削弱，從而有利于蛋白質水合作用的形成［２２］有關。從圖７、圖９得知，隨著液固比增大，提取率逐漸升高，這可能與隨著液固比增大蛋白質分子在兩相的分配更平衡有關。從圖８、圖１０得知，試驗范圍內，隨著浸提時間的延長，提取率緩慢上升，結合表３可知，浸提時間對蛋白質提取率影響不顯著。其原因可能為在本試驗條件下，浸提時間達到９０ｍｉｎ時，大多數蛋白質已經溶出，再延長浸提時間，蛋白質溶出量增加緩慢。前人研究野生大豆、獼猴桃子粕的蛋白質提取時，發現浸提時間的影響不顯著［２３，２４］。圖１１為固定溫度（４０℃）和ｐＨ（８．０），液固比和浸提時間兩者交互作用對水飛薊子可溶性蛋白質提取率的影響，雖然浸提時間對蛋白質提取率影響不顯著，但液固比和浸提時間的交互作用對提取率的影響顯著，較低的液固比需要較長的浸提時間，較短的浸提時間需要較高的液固比。這與表３的方差分析結果一致。

２．４．３水飛薊子可溶性蛋白質最佳提取條件的確定及驗證為了確定最佳提取條件的參數，分別對二次回歸方程①中的Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ求一階偏導數并令其等于零，可得下述四元一次方程組：＋６２．９６１ ６７＋０．０２０ ２５Ｂ＋０．０９１ ５０Ｃ－０．０３３ ７５Ｄ－７．４１０ ８４Ａ＝０；

－２．０６６ ０８＋０．０２０ ２５Ａ＋０．０１９ ００Ｃ＋０．００３ ２７Ｄ＋０．０１９ ０２Ｂ＝０；＋０．１７１ ７５＋０．０９１ ５０Ａ＋０．０１９ ００Ｂ－０．０１１ ３４Ｄ－０．００２ ３４Ｃ＝０；＋０．５３７ ０８－０．０３３ ７５Ａ＋０．００３ ２７Ｂ－０．０１１ ３４Ｃ＋０．００１ ４０Ｄ＝０。解上述方程組得Ａ＝８．９７，Ｂ＝５０，Ｃ＝６０，Ｄ＝９０；將Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ的值代入回歸方程①中，求得提取率最大值為５７．１０％。考慮實際操作，將最佳條件修正為提取液ｐＨ ９.0，溫度５０ ℃，液固比６０∶１，浸提時間９０ ｍｉｎ。為了驗證最佳提取參數，在此條件下（提取液ｐＨ為９.0，溫度５０ ℃，液固比６０∶１，浸提時間９０ ｍｉｎ）重復試驗３次，測定水飛薊子可溶性蛋白質提取率見表４。實測提取率為５６．０９％，略低于預測值５７．１０％，兩者相對標準偏差為１．２％，因此，驗證試驗證實了試驗模型和結果的可靠性。

３結論

應用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ中心組合設計原理，建立了水飛薊子脫脂粉末可溶性蛋白質提取工藝的數學模型，實測蛋白質提取率為３２．１１％～５０．７５％。該模型極顯著（Ｐ＜０．０１），失擬項不顯著（Ｐ＞０．０５），且相關系數較高（Ｒ＝0.８４３ ２），證明模型的可靠性及試驗誤差較小。響應面法優化水飛薊子脫脂粉末可溶性蛋白質提取工藝，最佳提取條件為提取液ｐＨ為９.0，溫度為５０ ℃，液固比為６０∶１，浸提時間為９０ ｍｉｎ，并可獲得水飛薊子脫脂粉末可溶性蛋白質提取率的最大實測平均值為５７．１０％。方差分析表明，在本試驗條件下，ｐＨ、ｐＨ二次項對蛋白質提取率有極顯著影響（Ｐ＜０．０１），溫度、液固比和液固比與浸提時間的交互作用對蛋白質提取率有顯著性影響（Ｐ＜０．０５），其他因素對蛋白質提取率影響不顯著（Ｐ＞０．０５）。驗證試驗證實了該模型及試驗結果的可靠性。

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