合浦珠母貝C型凝集素2的序列特征和表達分析

摘要：構建了合浦珠母貝（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ）的ｃＤＮＡ文庫，并通過ＥＳＴ序列篩選和重新測序獲得了一個新的Ｃ型凝集素基因的ｃＤＮＡ序列，命名為ＰｏＬＥＣ２，其長度為１ ６５９ ｂｐ，５’端非編碼區為３９ ｂｐ，３’端非編碼區為４５ ｂｐ，開放閱讀框為１ ５７５ ｂｐ，可編碼５２4個氨基酸；ＰｏＬＥＣ２蛋白的分子量約５８．０ ｋＤ，等電點為５．２；ＰｏＬＥＣ２蛋白包含一個信號肽序列（Ｍ１－Ａ１６）、一個ＭＡＭ－２結構域和一個Ｃ型凝集素的糖識別結構域。同源性分析結果表明，ＰｏＬＥＣ２與其他物種Ｃ型凝集素的糖識別結構域序列的同源性在２６．５％～３３．６％，相似性在４５．１％～５５．６％。組織表達分析表明，ＰｏＬＥＣ２基因在肝胰臟、鰓、外套膜、性腺及腸組織中均有表達，經溶藻弧菌刺激后８ｈ在腸組織中的表達量顯著上調。

關鍵詞：合浦珠母貝（Ｐｉｎｃｔａｄａ fucata）；Ｃ型凝集素；序列特征；表達分析

中圖分類號：Ｓ９１７．４ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）19－4026-05

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃ－ｔｙｐｅ Ｌｅｃｔｉｎ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｐｅａｒｌ Ｏｙｓｔｅｒ Ｐｉｎｃｔａｄａ fucata

ＨＵ Ｙｕ－ｔｉｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧ Ｄｉａｎ－ｃｈａｎｇ１，ＪＩＡＮＧ Ｓｈｉ－ｇｕｉ１，ＳＵ Ｔｉａｎ－ｆｅｎｇ１，ＣＵＩ Ｓｈｕ－ｇｅ１，３，ＧＵＯ Ｈｕａ－ｙａｎｇ１，２，ＣＨＥＮ Ｍｉｎｇ－ｑｉａｎｇ１

（１． Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３００， Ｃｈｉｎａ；

２． College ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｏｃｅａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１３０６， Ｃｈｉｎａ；

３． College ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｅａｒｌ ｏｙｓｔｅｒ（Ｐｉｎｃｔａｄａ fucata）． Ａ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｇｅｎｅ， ｎａｍｅｄ ａｓ ＰｏＬＥＣ２， ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ using ＥＳＴ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ １ ６５９ ｂｐ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ １５７５ ｂｐ． Ｔｈｅ ５’-ＵＴＲ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ３９ ｂｐ ａｎｄ ３’-ＵＴＲ ｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ４５ ｂｐ． Ｔｈｅ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ５２4 ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ａｂｏｕｔ ５８．０ ｋＤ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ ｏｆ ５．２． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ １６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ （Ｍ１-Ａ１６）， ａ ＭＡＭ－２ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ａ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｐ． fucata ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ were ２６．５％~３３．６％ ａｎｄ ４５．１％~５５．６％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰｏＬＥＣ２ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｔｉｓｓｕｅs ｏｆ Ｐ． fucata， ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｍａｘｉｍｕｍ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ａｆｔｅｒ ８ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｉｎｃｔａｄａ fucata； Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ

Ｃ型凝集素為一類鈣離子依賴活性的糖蛋白，具有至少一個糖識別結構域（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ，ＣＲＤ），能夠識別和結合細胞膜表面的糖基，其結合糖基具有專一性，即一種凝集素只能結合一種糖基［１，２］。Ｃ型凝集素是一種模式識別受體（Ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＲＲ）蛋白，主要有Ｍａｎ型配體（Ｍａｎ－ｔｙｐｅ ｌｉｇａｎｄｓ）和Ｇａｌ型配體（Ｇａｌ－ｔｙｐｅ ｌｉｇａｎｄｓ），Man型配體與Ｄ－甘露糖、Ｄ－葡萄糖結合，Gal型配體與Ｄ－半乳糖及其衍生物結合［２］。ＰＲＲ蛋白能識別病原微生物引起宿主的免疫應答，在無脊椎動物免疫防御中發揮著重要作用［１，２］。

合浦珠母貝（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ）又稱馬氏珠母貝，是我國海水珍珠的主要種類，由其所產的珍珠即為舉世聞名的“南珠”。近年來，由于養殖技術落后、養殖環境污染和種質退化，致使養殖合浦珠母貝出現了生長緩慢、病害頻發及死亡率高等現象［３］，嚴重影響了合浦珠母貝養殖業的發展。因此，必須加強合浦珠母貝免疫防御分子機制的研究，為其免疫防治策略的制定提供理論依據。目前在櫛孔扇貝（Ｃｈｌａｍｙｓ ｆａｒｒｅｒｉ）、海灣扇貝（Ａｒｇｏｐｅｃｔｅｎ ｉｒｒａｄｉａｎｓ）及長牡蠣（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ）等［４－８］軟體動物中初步開展了免疫防御分子機制的研究，發現在扇貝中存在多種Ｃ型凝集素基因，這種多樣性可能與其所面臨的海洋環境有關。中國水產科學研究院南海水產研究所養殖實驗室近年來在合浦珠母貝免疫防御分子機制方面開展了大量研究工作，獲得了多個免疫防御相關基因［９－１１］。本研究通過構建合浦珠母貝的ｃＤＮＡ文庫，獲得了一種新的Ｃ型凝集素基因，命名為ＰｏＬＥＣ２，通過生物信息學方法分析了其序列特征，并用實時熒光定量ＰＣＲ技術考察了其表達特征。

１材料與方法

１．１材料

合浦珠母貝來自海南省陵水縣新村珍珠貝養殖基地，體長５．５～７．０ ｃｍ，置于２５～２７ ℃充氣的海水中暫養１周。試驗以在閉殼肌內注射１００ μＬ ＰＢＳ緩沖液（ｐＨ值為６．８）的合浦珠母貝為對照組；以注射１００ μＬ溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）懸液（取過夜培養的溶藻弧菌懸浮于ＰＢＳ緩沖液中，ＯＤ６００ ｎｍ＝０．４）的合浦珠母貝為刺激組。取樣時每個試驗組取５～６只貝以消除個體間的差異。

１．２ｃＤＮＡ文庫構建和ＥＳＴ分析

取合浦珠母貝刺激８ ｈ后的全組織于液氮下研碎，采用ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）提取總ＲＮＡ，用ＺＡＰ－ｃＤＮＡ?誖Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Kｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＺＡＰ－ｃＤＮＡ?誖Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Kｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）和PｏｌｙＡ Ttｒａｃｔ?誖ｍＲＮＡ Iｓｏｌａｔｉｏｎ Sｙｓｔｅｍ ＩＩＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）等試劑盒（購自Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ公司）構建合浦珠母貝的ｃＤＮＡ文庫。挑取克隆測序后進行ＢＬＡＳＴＸ比對，發現其中一個ＥＳＴ序列與櫛孔扇貝（Ｃｈｌａｍｙｓ ｆａｒｒｅｒｉ，ＧｅｎＢａｎｋ登錄號為ＡＢＢ７１６７6）的Ｃ型凝集素基因的同源性較高，挑取該陽性克隆重新測序，獲得了合浦珠母貝的Ｃ型凝集素基因的cDNA序列，命名為ＰｏＬＥＣ２。

１．３序列分析

利用ＤＮＡＳｔａｒ軟件查找合浦珠母貝Ｃ型凝集素cDNA序列中最大開放閱讀框，用ＤＮＡＴｏｏｌ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０軟件將其翻譯為氨基酸序列。采用ＳｉｇｎａｌＰ ３．０［１２］軟件（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ＳｉｇｎａｌＰ/）對所編碼的氨基酸預測信號肽，利用ＳＭＡＲＴ程序［１３，１４］（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ． ｓｍａｒｔ． ｅｍｂｌｈ ｅｉｄｅｌｂ ｅｒｇ．ｄｅ/）和Ｓｃａｎ－Ｐｒｏｓｉｔｅ 程序（ｈｔｔｐ：//ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ/ｔｏｏｌｓ/）預測蛋白質結構，用Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐ：//ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ． ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ/）軟件預測空間結構。用ＣＬＵＳＴＡＬＷ程序進行多序列比對后，用ＢｉｏＥｄｉｔ程序進行同源性分析，并用ＭａｔＧＡＴ ２．０１ 軟件［１５］計算多序列的同源性和相似性。

１．４ＰｏＬＥＣ２基因表達分析

取未刺激的合浦珠母貝的肝胰臟、鰓、外套膜、腸和性腺用于組織表達模式分析，取溶藻弧菌刺激后０、２、４、８、１２、２４、４８、７２ ｈ合浦珠母貝的腸進行免疫應激試驗。以上組織均采用ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）提取總ＲＮＡ。提取的總ＲＮＡ用ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ的ＤＮａｓｅ Ｉ處理，用分光光度計定量，使參與反應的ＲＮＡ終濃度為２５ ｎｇ／μＬ，用ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔTM ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ ＤＲＲ０３７Ｓ）合成ｃＤＮＡ第一鏈，反應程序為３７ ℃ １５ ｍｉｎ，８５ ℃ ５ ｓ，反應完畢后將ｃＤＮＡ置－８０ ℃冰箱中保存備用。

根據已獲得的cDNA序列設計上游引物ＰｏＬＥＣ２－Ｆ（５′－ＧＧＣＧＡＡＡＣＴＡＴＣＡＡＣＡＡＡＡＧ－３′）和下游引物ＰｏＬＥＣ２－Ｒ（５′－ＣＣＡＡＴＧＡＡＣＡＴＡＣＧＡＡＧ

ＡＧＣ－３′），用β－ａｃｔｉｎ作內參，其上游引物為５′－ＧＡＣＴＧＡＧＧＣＴＣＣＡＣＴＣＡＡＣＣ－３′，下游引物為５′－ＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡ－３’，以ｃＤＮＡ第一鏈為模板，進行實時熒光定量ＰＣＲ反應。反應體系總體積為２０ μＬ，包含２× ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴaＫaＲa）１０ μＬ， ｃＤＮＡ １ μＬ，正反向引物各０．４ μＬ，雙蒸水８．２ μＬ，每個樣品設３個平行，并用雙蒸水代替ｃＤＮＡ模板作為陰性對照。反應程序為：９５ ℃預變性２ ｍｉｎ；９５ ℃變性１５ ｓ，６０ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸３０ ｓ，共４０個循環；７２ ℃延伸10 ｍｉｎ。采用ＣＴ值法（２－ΔΔＣＴ ｍｅｔｈｏｄ）［１６］和ＳＰＳＳ １３．０軟件進行數據分析。

２結果與分析

２．１序列分析

獲得的ＰｏＬＥＣ２序列已提交至ＧｅｎＢａｎｋ，其登陸號為ＨＱ８２７７８９。序列分析表明（圖１），ＰｏＬＥＣ２ ｃＤＮＡ序列的長度為１ ６５９ ｂｐ，其中開放閱讀框為

１ ５７５ ｂｐ，可編碼５２４個氨基酸，５’端非編碼區為３９ ｂｐ，３’端非編碼區為４５ ｂｐ。ＰｏＬＥＣ２蛋白的分子量約５８．０ｋＤ，等電點為５．２。ＰｏＬＥＣ２蛋白包含一個信號肽序列（Ｍ１－Ａ１６），一個ＭＡＭ－２結構域和一個糖識別結構域（ＣＲＤ），ＣＲＤ 序列含６個保守的半胱氨酸和１個糖結合位點ＱＰＮ。

２．２結構分析

利用Ｓｗｉｓｓ－ｍｏｄｅｌ軟件預測了ＰｏＬＥＣ２、ＰｏＬＥＣ１（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ，ＧｅｎＢａｎｋ登陸號：ＡＣＯ３６０４５）和櫛孔扇貝Ｃ型凝集素中ＣＲＤ的空間結構（圖２），這３個空間結構均由α螺旋、β折疊和線性結構構成，整個ＣＲＤ的空間結構形成一個緊湊的球形結構，３個序列的空間結構有很大的相似性，中間是β折疊片層，并形成２個反向平行結構（圖２ 橢圓所示）。

２．３同源性和相似性分析

ＰｏＬＥＣ２與其他已知物種的Ｃ型凝集素基因ＣＲＤ序列經ＭａｔＧAT軟件分析后，在所分析的物種中，其同源性在２６．５％～３３．６％之間，相似性在４５．１％～５５．６％之間，與櫛孔扇貝相似性最高，相似性達５５．６％（表１）。序列比對結果表明，所比對的Ｃ型凝集素序列有６個保守的半胱氨酸位點，后面４個半胱氨酸兩兩連接形成二硫鍵（圖３）。

２．４ＰｏＬＥＣ２基因的組織表達分析

組織表達分析結果表明，ＰｏＬＥＣ２基因在所檢測的組織中均有表達，其中在肝胰臟中的表達量顯著高于其他組織（Ｐ＜０．０５），在鰓、外套膜、腸和性腺中均有微量表達（圖4）。經溶藻弧菌刺激后，ＰｏＬＥＣ２基因在腸中的表達分析表明，刺激后８ ｈ，刺激組表達量相對于對照組顯著上調（Ｐ＜０．０１），其他時間段則無顯著差異（圖5）。

３討論

本研究獲得的ＰｏＬＥＣ２ ｃＤＮＡ序列的長度為

１ ６５９ ｂｐ，共編碼524個氨基酸，信號肽序列為Ｍ１－Ａ１６，成熟肽中包括了一個ＭＡＭ－２結構域和一個Ｃ型凝集素的ＣＲＤ，ＣＲＤ中有６個保守的半胱氨酸，后面４個半胱氨酸形成２個二硫鍵［１７］。同時，ＣＲＤ中存在糖結合位點，不同的糖結合位點有不同的糖結合特性，糖結合位點一般有ＥＰＮ、ＥＰＤ、ＱＰＤ和ＱＰＮ等，前兩者有甘露糖結合特性，后兩者有半乳糖結合特性［１８］，本序列的糖結合位點為ＱＰＮ，具有半乳糖結合特性。此外，ＣＲＤ功能域可能與其他功能域或基序相連，ＰｏＬＥＣ２的ＣＲＤ與ＭＡＭ－２結構域相連，該功能域有粘附功能。Ｃ型凝集素基因中存在一個或幾個相同的ＣＲＤ與幾個不同的ＣＲＤ，而ＣＲＤ的作用是與鈣離子一起介導糖基的結合［１９］。單個ＣＲＤ一般存在于比較低等生物的Ｃ型凝集素中，其他物種的Ｃ型凝集素有幾個相同的或不同的ＣＲＤ［２０］，在ＰｏＬＥＣ２中只存在一個ＣＲＤ結構。ＰｏＬＥＣ２的空間結構分析結果表明，ＰｏＬＥＣ２的ＣＲＤ結構和ＰｏＬＥＣ１、櫛孔扇貝的ＣＲＤ的空間結構十分相似，均形成一個緊湊的球形結構，并形成２個反向平行結構，Ｃ型凝集素結構域的空間構型是一個雙環結構。一個為Ｎ－末端和Ｃ－末端的β鏈緊靠在一起形成了一個反平行的β片層，另一個為“長環”被包含在結構域當中［２１］。

同源性分析結果表明，ＰｏＬＥＣ２與其他已知物種的Ｃ型凝集素基因ＣＲＤ序列的同源性在２６．５％～３３．６％之間，相似性在４５．１％～５５．６％之間，其中與櫛孔扇貝相似性最高為５５．６％。Ｃ型凝集素基因在不同物種間的同源性和相似性相對比較低，孫允東［２２］也指出在同一類對蝦中，Ｃ型凝集素的相似性不是很高。

組織表達分析研究表明，ＰｏＬＥＣ２基因在合浦珠母貝肝胰臟中的表達水平最高，在性腺中的表達水平最低，有關文獻表明，Ｃ型凝集素在貝類各個組織中的表達水平是不同的，如櫛孔扇貝Ｃｆｌｅｃ－４等的Ｃ型凝集素在肝胰臟中的表達量是最高的，在其他組織中也有所表達［４－６］。腸的時序表達分析表明，刺激后８ ｈ表達量顯著上調，這表明合浦珠母貝的Ｃ型凝集素可能參與了其免疫反應，在合浦珠母貝免疫防御中起重要作用。

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［１４］ ＣＡＭＰＡＮＥＬＬＡ Ｊ Ｊ， ＢＩＴＩＮＣＫＡ Ｌ， ＳＭＡＬＬＥＹ Ｊ． ＭａｔＧＡＴ：ａｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ／ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｍａｔｒｉｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］． ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００３，４（１）： ２９－３２．

［１５］ ＬＥＴＵＮＩＣ Ｉ，ＣＯＰＬＥＹ Ｒ Ｒ，ＰＩＬＳ Ｂ，ｅｔ ａｌ． ＳＭＡＲＴ ５：ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅｓ ａｎｄ ｎｅｔｗｏｒｋｓ［Ｊ］． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，３４（ｓｕｐｐｌ １）：２５７－２６０．

［１６］ 陳慕雁，楊紅生．貝類生態免疫研究進展［Ｊ］． 海洋科學集刊，２００７，４８：１４０－１５２．

［１７］ ＺＨＡＮＧ Ｈ， ＲＯＢＩＳＯＮ Ｂ，ＴＨＯＲＧＡＡＲＤ Ｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｉｓｈ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ ｒａｉｎｂｏｗ ｔｒｏｕｔ（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｍｙｋｉｓｓ） ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ２０００，１４９４（１－２）：１４－２２．

［１８］ ＤＲＩＣＫＡＭＥＲ Ｋ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｇａｌａｃｔｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｔｏ ａ Ｃ－ｔｙｐｅ ｍａｎｎｏｓｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］． Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３６０（６４００）：１８３－１８６．

［１９］ ＤＡＹ Ａ Ｊ． Ｔｈｅ Ｃ－ｔｙｐｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ（ＣＲＤ） ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，１９９４，２２（１）：８３－８８．

［２０］ ＳＯＮＧ Ｘ Ｙ，ＺＨＡＮＧ Ｈ，ＺＨＡＯ Ｊ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ ｇａｌｅｃｔｉｎ ｆｒｏｍ ｂａｙ ｓｃａｌｌｏｐ Ａｒｇｏｐｅｃｔｅｎｓ ｉｒｒａｄｉａｎｓ［Ｊ］． Ｆｉｓｈ ＆ Ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０，２８（２）：３２６－３３２．

［２１］ ＷＡＬＫＥＲ Ｊ Ｒ， ＮＡＧＡＲ Ｂ， ＹＯＵＮＧ Ｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｘ－ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｇａｌａｃｔｏｓｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃ－ｔｙｐｅ ｌｅｃｔｉｎ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ｄｅｃａｍｅｒｉｃ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４， ４３（１３）： ３７８３－３７９２．

［２２］ 孫允東． 中國對蝦血小板反應素和Ｃ－型凝集素基因克隆表達和功能研究［Ｄ］． 濟南：山東大學，２００６．