一株利用木糖產(chǎn)乙醇酵母菌的發(fā)酵條件的優(yōu)化

摘要：以實驗室保藏的一株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇能力較強的酵母菌為研究對象，利用響應(yīng)面法對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。最適發(fā)酵條件為溫度３０．０ ℃、ｐＨ ６．０、接種量１５．００％、靜置發(fā)酵２４ ｈ，理論獲得培養(yǎng)基中乙醇含量為１．４４７ ｇ／Ｌ。

關(guān)鍵詞：木糖；酵母；乙醇；響應(yīng)面法

中圖分類號：Ｘ１７２；ＴＫ６ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）19－4038-03

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ A Ｙｅａｓｔ Ｓｔｒａｉｎ Ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ Ｘｙｌｏｓｅ

ｔｏ Ｅｔｈａｎｏｌ

ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ－ｌｏｎｇ１，２，ＪＩ Ｘｉａｎｇ１，2，ＣＡＩ Ｌｕ１，2

（1. Institude of Bioengineering and Technology， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ， Ｃｈｉｎａ； 2. Inner Mongolia Key Laboratory of Biomass-energy Conversion，Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ａ ｙｅａｓｔ ｓｔｒａｉｎ ｔｈａｔ ｃｏｕｌｄ ｆｅｒｍｅｎｔ ｘｙｌｏｓｅ ｔｏ ｅｔｈａｎｏｌ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｆ ｉｎｏｃｕｌｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ １５．００％， ｐＨ ６．０， ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ２４ ｈ ａｔ ３０．０ ℃， ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ １．４４７ ｇ／Ｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｘｙｌｏｓｅ； ｙｅａｓｔ； ｅｔｈａｎｏｌ； ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ

發(fā)展可再生能源，特別是生物能源是解決能源危機的重要手段，其中燃料乙醇由于其成熟的生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)和豐富的原料來源成為世界各國首選的生物能源。燃料乙醇的生產(chǎn)原料中，木質(zhì)纖維原料因其最為豐富和廉價而引起了廣泛的關(guān)注。木質(zhì)纖維原料中半纖維素約占２０％～４０％［１－３］，８５％～９０％的半纖維素水解產(chǎn)物是木糖［４］，所以木糖的乙醇發(fā)酵被視為植物纖維原料生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的關(guān)鍵［５］。以實驗室保藏的一株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇能力較強的酵母菌為實驗對象，對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，以期為該菌株在木質(zhì)纖維素燃料乙醇生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

實驗用酵母菌為內(nèi)蒙古科技大學生物工程與技術(shù)研究所篩選。

１．２方法

１．２．１菌種發(fā)酵時間的確定將菌種種子液５ ｍＬ接入裝液量為５０ ｍＬ的木糖發(fā)酵培養(yǎng)基［５０ ｇ／Ｌ木糖＋１０ ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４＋２ ｇ／Ｌ酵母粉＋２ ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ＋１ ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４］ 的２５０ ｍＬ三角瓶中，３５ ℃、７０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別為２４、４８、７２ ｈ，反應(yīng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基中乙醇含量、木糖殘余量和木糖轉(zhuǎn)化率，確定其最佳發(fā)酵時間。

１．２．２菌種發(fā)酵的厭氧好氧實驗［6-8］將種子液１０ ｍＬ接入裝液量為１００ ｍＬ的木糖發(fā)酵培養(yǎng)基的２５０ ｍＬ三角瓶中，在３５ ℃分別靜置和７０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)４８ ｈ，反應(yīng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基中乙醇含量、木糖殘余量及木糖轉(zhuǎn)化率，分析發(fā)酵特性。

１．２．３目標菌種發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化根據(jù)１．２．１與１．２．２的實驗結(jié)果，采用ｄｅｓｉｇｎ－ｅｘｐｅｒｔ軟件，以溫度、ｐＨ、接種量為自變量，發(fā)酵后培養(yǎng)基中乙醇含量為響應(yīng)值（Ｙ），設(shè)計３因素３水平響應(yīng)面實驗（表１）。

１．２．４指標測定①乙醇含量：采用重鉻酸鉀氧化分光光度法測定［9］；②木糖殘余量：采用３，５－二硝基水楊酸（ＤＮＳ）法測定［10］；③木糖轉(zhuǎn)化率＝乙醇產(chǎn)量／［培養(yǎng)基中初始木糖量－木糖殘余量］×１００％。

２結(jié)果與分析

２．１菌種發(fā)酵時間研究

培養(yǎng)基中乙醇含量隨發(fā)酵時間的延長先逐步上升，在４８ ｈ時達到峰值，之后隨時間的延長而下降（圖１），可能是發(fā)酵產(chǎn)物被菌株消耗引起的；木糖含量隨時間的延長呈下降趨勢（圖２），可見菌株在７２ ｈ內(nèi)一直在對木糖進行利用；木糖轉(zhuǎn)化率隨發(fā)酵時間的延長下降（圖３），可見菌株隨著發(fā)酵的進行會消耗產(chǎn)物，導(dǎo)致木糖轉(zhuǎn)化率下降，從轉(zhuǎn)化效率來看發(fā)酵時間以２４ ｈ為宜。

２．２菌種發(fā)酵的厭氧好氧實驗

對目標菌株進行厭氧好氧實驗，結(jié)果表明，靜置發(fā)酵２４ ｈ后，培養(yǎng)基中乙醇含量為１．１４７ ｇ／Ｌ，木糖轉(zhuǎn)化率為６６．３％，７０ ｒ／ｍｉｎ搖床發(fā)酵２４ ｈ，培養(yǎng)基中乙醇含量為１．０７６ ｇ／Ｌ，木糖轉(zhuǎn)化率為４８．６％。可見與７０ ｒ／ｍｉｎ搖床發(fā)酵相比，靜置發(fā)酵乙醇產(chǎn)量和木糖的轉(zhuǎn)化率都更高。

２．３目標菌種發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

在５０ ｍＬ種子培養(yǎng)基，靜置發(fā)酵２４ ｈ的條件下進行響應(yīng)面分析，實驗結(jié)果見表２，方差分析見表３。對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，可得發(fā)酵后培養(yǎng)基中乙醇含量對溫度、ｐＨ和接種量的三元二次回歸方程為：Ｙ＝０．９３＋０．１６Ｘ1＋０．１１Ｘ２＋０．２３Ｘ３－０．０１８Ｘ1Ｘ２－０．２６Ｘ1Ｘ３＋０．０５３Ｘ２Ｘ３。模型的Ｐ＜０．０１，表明模型是顯著的；調(diào)整確定系數(shù)Ｒ２＝０．９５９ ６，表明該模型能很好地描述實驗結(jié)果。

響應(yīng)面和等高線圖見圖４。溫度和接種量與培養(yǎng)基中乙醇含量存在顯著的相關(guān)性，溫度與接種量之間交互作用顯著，溫度低且接種量大則培養(yǎng)基中乙醇含量高；而ｐＨ對發(fā)酵后培養(yǎng)基中乙醇含量的影響不顯著，與溫度、接種量之間的交互作用不明顯。

利用軟件分析得到乙醇含量最高的發(fā)酵條件為溫度３０．０ ℃、ｐＨ ６．０，接種量１５．００％，理論獲得乙醇含量為１．４４７ ｇ／Ｌ。

３結(jié)論

對實驗室保藏的一株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇能力較強的酵母菌的生長條件進行了初步研究。結(jié)果表明，最適合菌株產(chǎn)乙醇的條件為３０.0 ℃，接種量為１５．００％，培養(yǎng)基的初始ｐＨ為６．０，靜置發(fā)酵２４ ｈ。

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