γ-聚谷氨酸明膠膜對重金屬離子吸附特性研究

摘要：利用蠟狀芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）液體發酵制備γ－聚谷氨酸（Ｐｏｌｙ－γ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ，γ－ＰＧＡ），提取并制得γ－ＰＧＡ溶液；以０．５ ｇ／Ｌ的γ－ＰＧＡ溶液與明膠交聯制成明膠膜，未交聯γ－ＰＧＡ的明膠膜作空白對照，用原子吸收分光光度法檢測金屬離子消耗，研究γ－ＰＧＡ明膠膜對Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋的吸附特性。實驗結果表明，Ｃｕ２＋在ｐＨ為８、２４ ℃、５ ｈ時有最佳吸附量，飽和吸附量為１２．３４ μｇ／ｍＬ；Ｃｏ２＋在ｐＨ ７、２１ ℃、５ ｈ時有最佳吸附量，飽和吸附量為１９．５０ μｇ／ｍＬ；證實了γ－ＰＧＡ與明膠交聯制成的明膠膜具有吸附重金屬（Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋）的能力。

關鍵詞：蠟狀芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）；γ－ＰＧＡ；金屬離子；明膠膜；吸附特性

中圖分類號：Ｘ５９２；Ｑ９３９．９９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）19－3956-04

Study on the Adsorption Characteristic of Metal Ions on Gelatin Membrane

Cross-linked Poly-γ-glutamic Acid

ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｂｉｎ１，２，ＣＨＥＮＧ Ｍｉｎｇ３，ＳＨＥＮＧ Ｊｕ２，ＹＡＮＧ Ｙａｎ－ｙａｎ２，ＬＩ Ｓｈｉ－ｈｕ２，ＹＡＮ Ｂｉｎ－ｌｕｎ２

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Eｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Sｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Sｐａｔｉａｌ Iｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， Ｃｈｉｎａ Uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Mｉｎｉｎｇ ａｎｄ Tｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｕｚｈｏｕ ２２１１１６， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｈｕａｉhａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００５， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ；

３． Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ Rｏｎｇｓｈｅｎｇ Bｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．， Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００５， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Pｏｌｙ－γ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ （γ－ＰＧＡ） ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ． Ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｂｙ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ γ－ＰＧＡ（０．５ ｇ／Ｌ） ｗｉｔｈ ｇｅｌａｔｉｎ． Ｔｈｅ ｎｏｎ－ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗａｓ ｓｅｒｖｅｄ ａｓ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｔｈｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｕ２＋ ａｎｄ Ｃｏ２＋ ｏｎ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ａｔｏｍｉｃ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｕ２＋ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ｐＨ ８ ａｔ ２４ ℃ ｆｏｒ ５ ｈ， ａｎｄ ｔｈｅ ｌａｒｇｅｓｔ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｏ２＋ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ｐＨ ７ ａｔ ２１ ℃ ｆｏｒ ５ ｈ． It was ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ γ－ＰＧＡ ａｎｄ ｇｅｌａｔｉｎ ｗａｓ capable ｆｏｒ ｔｈｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ （Ｃｕ２＋ ａｎｄ Ｃｏ２＋）． Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｃｙｃｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖａｌｕａｂｌｅ ｍｅｔａｌｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ； γ－ＰＧＡ； ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ； ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ； ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ

γ－聚谷氨酸（Ｐｏｌｙ γ－ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）簡稱γ－ＰＧＡ，γ－ＰＧＡ是一種由微生物大量生物合成的陰離子型多聚氨基酸，是一種谷氨酸的高分子聚合物，對人類和環境無毒無害［１］。由于其分子量特別大并且側鏈上具有游離的羧基，可以與水中的膠體顆粒相吸附，在適宜的條件下，顆粒之間能夠通過產生“架橋”現象形成一種三維的網狀結構而沉降，可以作為一種新型的生物絮凝劑應用于水的純化和加工以及食品和發酵工業的下游處理［２］。同時，γ－ＰＧＡ是一種出色的綠色塑料，它在自然界可迅速降解，不會造成環境污染。因而，篩選合適的能產具有絮凝活性的γ－ＰＧＡ產生菌是當前的研究熱點之一。迄今已經發現了幾種產生菌，主要是芽孢桿菌屬（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）的菌株，包括各種枯草芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）［３］、地衣芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）［４］、炭疽芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）［５］和納豆芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ），但對于蠟狀芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）發酵產生γ－ＰＧＡ及其絮凝特性的研究鮮見報道。

本實驗通過自行篩選獲得了一株產γ－ＰＧＡ的蠟狀芽孢桿菌ＨＹＷＬ－１，對其所產的γ－ＰＧＡ進行了對重金屬離子吸附特性的研究。由于γ－ＰＧＡ具有很強的水溶性，如將其作為工業廢水處理中對金屬離子的吸附劑就需尋找一種合適的載體，這既能夠讓γ－ＰＧＡ附著在其上不隨水流失，又能不破壞其陰離子特性保持其對于金屬離子的吸附性能；為此，本實驗選擇明膠作為膜載體，將γ－ＰＧＡ與其交聯［６］；旨在為環保行業、污廢水處理及金屬離子回收利用方面提供基礎理論依據。

１材料與方法

１．１菌種

蠟狀芽孢桿菌ＨＹＷＬ－１，為淮海工學院海洋學院微生物實驗室分離選育的產γ－ＰＧＡ菌株。

１．２培養基及培養方法

１．２．１種子培養基牛肉膏蛋白胨培養基。

１．２．２發酵培養基（ｇ／Ｌ）檸檬酸 １０．００，味精（河南蓮花味精股份有限公司）２０．００，ＮＨ４Ｃｌ ４．００，Ｋ２ＨＰＯ４ １．００，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．５０，ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ ０．０２，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．０５，ｐＨ ７．５，１２１ ℃滅菌２０ ｍｉｎ。

１．２．３細菌培養３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培養４８ ｈ后按８％（體積分數）的接種量將種子培養液轉到發酵搖瓶內，２００ ｒ／ｍｉｎ、３７ ℃培養。

１．３實驗方法

１．３．１液體發酵制備γ－ＰＧＡ取２００ μＬ菌種接入種子培養液中，于３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ恒溫培養箱中振蕩培養２４ ｈ；按８％（體積分數）的接種量將種子培養液接入液體發酵培養基中，于３７ ℃、２００ ｒ／ｍｉｎ培養４８ ｈ；將發酵液用去離子水稀釋（體積比為１∶１），調節ｐＨ至２．０～３．０，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心去菌體；再將ｐＨ調節至７．０，用２倍體積95%乙醇沉淀過夜，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心獲取沉淀；固體沉淀物用蒸餾水溶解，再用２倍體積95%乙醇沉淀，重復３～４次；將最終的γ－ＰＧＡ在６０ ℃恒溫條件下干燥３ ｈ，獲得精品，４ ℃保存備用。

１．３．２明膠膜的制備［６］將生物膠（Ａ液：４０ ｍｇ／ｍＬ γ－ＰＧＡ和２０ ｍｇ／ｍＬ明膠的混合液；Ｂ液：１６０ ｍｇ／ｍＬ １－３－二甲氨基丙基－３－乙基碳二亞胺；兩種溶液等量混合）注入平皿中，室溫條件下水平靜止１０ ｍｉｎ后即可制得生物膠凝固膜。

１．３．３γ－ＰＧＡ明膠膜對重金屬銅離子的吸附

１）Ｃｕ２＋最佳吸附時間。１ ｇ交聯過γ－ＰＧＡ的明膠膜放入５０ ｍＬ濃度為５０ μｇ／ｍＬ的ＣｕＳＯ４溶液中，２４ ℃、６０ ｒ／ｍｉｎ條件下進行吸附；用未交聯明膠膜作對照。每組３個平行，時間設置１～６ ｈ，每隔１ ｈ每組樣品用原子吸收分光光度法［７］（ＴＡＳ－９９０原子吸收分光光度計，北京普析通用分析儀器有限公司）測金屬離子含量，得出吸附量（下同）。以吸附量最大時的吸附時間為最佳吸附時間。

２）Ｃｕ２＋最佳吸附溫度。１ ｇ交聯過γ－ＰＧＡ的明膠膜放入５０ ｍＬ濃度為５０ μｇ／ｍＬ的ＣｕＳＯ４溶液中，溫度設置１５、１８、２１、２４、２７、３０ ℃等６個梯度，６０ ｒ／ｍｉｎ吸附５ ｈ，取出樣液測定各組的吸附量，吸附量最大時的吸附溫度為吸附最佳溫度。以未交聯明膠膜作對照，每組３個平行。

３）Ｃｕ２＋吸附飽和濃度。１ ｇ明膠膜分別放入５０ ｍＬ濃度分別為５０、１００、２００、４００、６００ μｇ／ｍＬ的ＣｕＳＯ４溶液中，２４ ℃、６０ ｒ／ｍｉｎ條件下吸附５ ｈ，取出樣液測定各組的吸附量，以吸附量最大值為飽和吸附量，Ｃｕ２＋濃度為吸附飽和濃度。以未交聯明膠膜作對照，每組３個平行。

４）Ｃｕ２＋最佳吸附ｐＨ。１ ｇ明膠膜放入５０ ｍＬ濃度為５０ μｇ／ｍＬ的ＣｕＳＯ４溶液中，ｐＨ設置４、５、６、７、８、９等６個梯度，６０ ｒ／ｍｉｎ吸附５ ｈ，取出樣液測定各組的吸附量，以吸附量最大時的ｐＨ為吸附最佳ｐＨ。以未交聯明膠膜作對照，每組３個平行。

１．３．４γ－ＰＧＡ明膠膜對重金屬鈷離子的吸附方法同１．３．３，研究γ－ＰＧＡ明膠膜對ＣｏＣｌ２·２Ｈ２Ｏ溶液（１００ μｇ／ｍＬ）中Ｃｏ２＋的最佳吸附溫度、最佳吸附時間、最佳吸附ｐＨ、飽和吸附量及吸附飽和濃度（Ｃｏ２＋濃度設置25、50、100、150、200 μｇ／ｍＬ等5個梯度）。

２結果與分析

蠟狀芽孢桿菌ＨＹＷＬ－１液體發酵提取制備γ－ＰＧＡ，最終產量為２６．４８ ｇ／Ｌ。

２．１γ－ＰＧＡ交聯明膠膜吸附Ｃｕ２＋的研究

２．１．１Ｃｕ２＋最佳吸附時間由圖１可知，隨著吸附反應時間的延長，實驗組與對照組吸附量均有所增加，當吸附反應進行到５ ｈ時，吸附量達到最大值（８．７０ μｇ／ｍＬ），高出對照組３８％。而反應時間繼續延長，吸附量（８．６７ μｇ／ｍＬ）略有下降。對照組在開始時吸附量有所增加，４ ｈ后有所下降。在進行至第５、６ 小時，實驗組與對照組相比差異顯著。實驗結果表明，最佳吸附時間為５ ｈ。

２．１．２Ｃｕ２＋最佳吸附溫度由圖２可知，在１５～２４ ℃范圍內，隨著溫度的升高，實驗組和對照組的吸附量均逐漸增大；當溫度為２４ ℃時，實驗組吸附量最高，為９．２１ μｇ／ｍＬ，較對照組（４．６２ μｇ／ｍＬ）增加９９．３５％；隨著溫度的繼續升高，吸附量有下降的趨勢。除１５ ℃時實驗組與對照組相比無顯著差異外；其他溫度試驗組與對照組相比差異均顯著。實驗表明２４ ℃為最佳吸附溫度。

２．１．３Ｃｕ２＋飽和吸附量由圖３可知，對照組的明膠膜在不同濃度的ＣｕＳＯ４溶液中的吸附量差別不大，由于明膠膜本身對于Ｃｕ２＋有一定的吸附量，很快就能達到飽和。而交聯實驗組的明膠膜的吸附量則有明顯變化，在濃度為4００ μｇ／ｍＬ的ＣｕＳＯ４溶液中的吸附量最大，達１２．３４ μｇ／ｍＬ，是對照組吸附量的３．５倍，而隨Ｃｕ２＋濃度的繼續增加，吸附量沒有進一步增加的趨勢，說明實驗組明膠膜的吸附量在Ｃｕ２＋濃度為4００ μｇ／ｍＬ時即達到吸附量的飽和。Ｃｕ２＋濃度為200、４００、６００ μｇ／ｍＬ時，實驗組與對照組相比差異均顯著。

２．１．４Ｃｕ２＋最佳吸附ｐＨ由圖４可知，ｐＨ為８時，明膠膜對Ｃｕ２＋的吸附量達到最高值（７．５ μｇ／ｍＬ），ｐＨ繼續升高吸附量呈下降趨勢。除ｐＨ為４時的實驗組與對照組相比無顯著差異外，其他各實驗組與對照組相比差異均顯著。

２．２γ－ＰＧＡ交聯明膠膜吸附Ｃｏ２＋的研究

２．２．１Ｃｏ２＋的最佳吸附時間由圖５可知，隨著吸附反應時間的延長，實驗組吸附量均有所增加，當吸附反應進行到５ ｈ時，吸附量達到最大值（８．３ μｇ／ｍＬ），高出對照組３９％。反應時間繼續延長至６ ｈ時，吸附量沒有變化。對照組吸附量在１、２、３ ｈ時基本無變化，直至第４小時時才略有增加。第５、６小時時的實驗組與對照組相比差異均顯著。明膠膜吸附Ｃｏ２＋的最佳吸附時間為５ ｈ。

２．２．２Ｃｏ２＋的最佳吸附溫度在１５～２１ ℃范圍內，隨著溫度的升高，實驗組吸附量均有所增加；２１ ℃時吸附量達到最大值，為５．９９ μｇ／ｍＬ，高于對照組６６％。而當溫度高于２１ ℃后，隨著溫度的升高，吸附量有下降的趨勢。對照組吸附量則變化不明顯。２１、２４ ℃時，實驗組與對照組相比差異均顯著。實驗表明２１ ℃為明膠膜吸附Ｃｏ２＋的最佳溫度（圖６）。

２．２．３Ｃｏ２＋飽和吸附量及吸附飽和濃度由圖７可知，對照組明膠膜隨著ＣｏＣｌ２溶液濃度的增加吸附量呈增加趨勢，但較實驗組相比變化較小。在濃度為１５０ μｇ／ｍＬ的ＣｏＣｌ２溶液中的吸附量最大，達１９．５０ μｇ／ｍＬ，而此后增加Ｃｏ２＋的濃度，吸附量沒有變化，說明實驗組明膠膜的吸附量在Ｃｏ２＋濃度為１５０ μｇ／ｍＬ時達到吸附量的飽和。濃度為１５０、２００ μｇ／ｍＬ時，實驗組與對照組相比差異均顯著。

２．２．４Ｃｏ２＋最佳吸附ｐＨ由圖８可知，ｐＨ為７時，明膠膜對Ｃｏ２＋的吸附量達到最高值（７．６７ μｇ／ｍＬ），ｐＨ繼續升高時吸附量則呈下降趨勢。除ｐＨ為４時實驗組與對照組相比差異不顯著外；其他各實驗組與對照組相比差異均顯著。

３討論

本實驗基于蠟狀芽孢桿菌發酵產生的γ－ＰＧＡ與明膠膜相交聯，對其吸附Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋的特性進行了探索性研究。實驗表明，交聯γ－ＰＧＡ的明膠膜對上述兩種金屬離子確實有很好的吸附性，并對每種金屬離子都有一個最佳吸附ｐＨ、最佳吸附時間、最佳吸附溫度及飽和吸附量。Ｃｕ２＋在ｐＨ為８、２４ ℃、５ ｈ時有最佳吸附量，飽和吸附量為１２．３４ μｇ／ｍＬ；Ｃｏ２＋在ｐＨ為７、２１ ℃、５ ｈ時有最佳吸附量，飽和吸附量為１９．５０ μｇ／ｍＬ。

現代環境污染特別是工業廢水及養殖水環境污染是由重金屬離子所造成的，當銅離子質量濃度達０．１～０．２ ｍｇ／Ｌ時即可使魚類致死［７］。近年來，在利用微生物及其代謝產物從溶液中吸附重金屬方面進行了較多的研究，取得了多項成果；既克服了化學法處理中化學吸附劑不具備生物可降解性，容易對環境造成污染的缺點；又利于重金屬離子回收利用。本實驗探討了蠟狀芽孢桿菌發酵產生γ－ＰＧＡ與明膠交聯后對重金屬離子的吸附特性，研究了時間、溫度、金屬離子濃度及ｐＨ對明膠膜吸附量的影響，Ｃｕ２＋的實驗結果與王嬙等［７］的報道有所差異，可能是由于助交聯劑不同而導致交聯效率不同。本實驗中，測得明膠膜對重金屬離子有較強的吸附能力，由于γ－ＰＧＡ為陰離子型多聚氨基酸，易與陽離子結合，γ－ＰＧＡ對金屬離子的吸附能力在環境保護以及工業廢水處理上有很廣泛的應用前景，具有十分重要的潛在應用價值。當明膠膜吸附金屬離子達到飽和時，可以將金屬離子與明膠膜分離，使金屬離子和明膠膜都能回收利用，這一研究將在金屬離子回收方面有重要前景。

參考文獻：

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