粘毛黃芩毛狀根外源基因表達系統的建立

摘要：用攜帶植物高效表達載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋和發根型質粒ｐＲｉＡ４，“解除武裝”的重組Ｃ５８Ｃ１工程菌感染粘毛黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ.）無菌苗的幼莖、子葉、葉片，誘導毛狀根的表達，以建立基于粘毛黃芩毛狀根的高效外源基因表達系統。幼莖毛狀根誘導率最高，達８８．９％。ＰＣＲ擴增檢測粘毛黃芩毛狀根單克隆基因組中的ｒｏｌＣ和ｈｙｇｒ基因片段，結果表明，ｐＲｉＡ４和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋均能整合到粘毛黃芩毛狀根的基因組內，共轉化率達２８．１％。

關鍵詞：粘毛黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ.）；毛狀根；共轉化

中圖分類號：Ｓ５６７．２３＋９ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）19－4070-03

Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ bａｓｅｄ ｏｎ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｈａｉｒｙ Ｒｏｏｔｓ

ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｆａｎｇ１，ＬＩ Ｆｅｎｇ－ｈｕａ１，ＳＵＮ Ｍｉｎ２

（１． Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ；

２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｄｉｓａｒｍｅｄ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ Ｃ５８Ｃ１ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＲｉＡ４ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｆｅｃｔ ｔｈｅ ｙｏｕｎｇ ｓｔｅｍ， ｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ． ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｆｒｏｍ ｓｔｅｍｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｒｅａｃｈｅｄ ｕｐ ｔｏ ８８．９％． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｗａｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ rｏｌＣ ａｎｄ hｙｇｒ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｓ． ｖｉｓｃｉｄｕｌａ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ ｏｆ Ｓ． ｖｉｓｃｉｄｕｌａ， ｗｉｔｈ ａ ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ２８．１％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ.； ｈａｉｒｙ ｒｏｏｔｓ； ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ

粘毛黃芩（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｖｉｓｃｉｄｕｌａ Ｂｕｎｇｅ．）是唇形科（Ｌａｂｉａｔａｅ）黃芩屬（Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ）多年生草本植物［１，２］，其藥用成分主要分布于根部。藥理上已證實其中的主要成分黃芩苷和黃芩苷元有抑菌、清熱、降壓、鎮靜、利尿、利膽、抗炎、解毒及抑制ＨＩＶ病毒逆轉錄酶活性等作用［３］。隨著對植物代謝網絡認識的加深，應用基因工程技術對植物次生代謝途徑進行遺傳改良已取得了可喜的進展。本研究用攜帶植物高效表達載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋（攜帶一個潮霉素抗性基因ｈｙｇｒ）“解除武裝（Ｄｉｓａｒｍｅｄ）”的重組Ｃ５８Ｃ１工程菌感染粘毛黃芩無菌苗的不同外植體誘導出毛狀根，建立粘毛黃芩毛狀根的高效外源基因表達系統，以期為其次生代謝產物黃酮類化合物的生物合成關鍵酶基因導入，并實現產業化大量生產奠定基礎。

１材料與方法

１．１菌株及植物材料

重組Ｃ５８Ｃ１工程菌由西南大學廖志華教授惠贈，Ｃ５８Ｃ１本來是根癌農桿菌，經“解除武裝”改造后，保留Ｈｅｌｐｅｒ質粒，導入發根質粒ｐＲｉＡ４，改造后的Ｃ５８Ｃ１失去使植物長冠癭組織的能力，成為發根農桿菌。粘毛黃芩種子購買于山西省絳縣遠博農副產品公司。

１．２方法

１．２．１農桿菌的活化取保存的工程菌Ｃ５８Ｃ１菌種，劃線接種于ＹＥＢ固體培養基上（５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ＋４０ ｍｇ／Ｌ Ｒｉｆ），２８ ℃培養，固體培養基上活化２次。挑取單菌落，接種于ＹＥＢ液體培養基（５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ＋４０ ｍｇ／Ｌ Ｒｉｆ）中，２８ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ培養過夜，當ＯＤ６００ ｎｍ＝０．６時進行第4次活化，在ＯＤ６００ ｎｍ＝０．３時加１００ μｍｏｌ／Ｌ乙酰丁香酮（ＡＳ），繼續振蕩培養至ＯＤ６００ ｎｍ＝０．５，室溫下４ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄上清液，菌體用等體積ＭＳ＋１００ μｍｏｌ／Ｌ ＡＳ液體培養基懸浮培養，２８ ℃、１５０ ｒ／ｍｉｎ繼續活化３０ ｍｉｎ，可用于侵染。

１．２．２粘毛黃芩無菌苗的獲得選取飽滿種子用自來水浸泡８ ｈ，然后流水沖洗５ ｈ，體積分數７５％的乙醇浸泡３０ ｓ，無菌水沖洗３次，質量分數０．１％的 ＨｇＣl２浸泡１２ ｍｉｎ，無菌水洗滌５次，接種于ＭＳ固體培養基上，２５ ℃連續暗培養。７ ｄ后，種子陸續萌發。

１．２．３毛狀根的誘導分別切取４～５ ｄ苗的子葉、１４～１５ ｄ苗的幼莖和葉片置于ＭＳ無激素固體培養基上進行１ ｄ的預培養。將上述外植體在活化好的Ｃ５８Ｃ１菌液中侵染１５ ｍｉｎ，取出并吸干多余菌液，放在ＭＳ＋１００ μｍｏｌ／Ｌ ＡＳ固體培養基上，共培養２～３ ｄ，直到外植體周圍出現明顯菌斑，用吸水紙吸干外植體上菌斑，轉接于固體除菌培養基（ＭＳ＋５００ ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ）上，于２５ ℃暗培養除菌并誘導毛狀根，２０ ｄ后統計毛狀根誘導率。對照組不用發根農桿菌菌液浸染，直接放在ＭＳ＋１００ μｍｏｌ／Ｌ ＡＳ固體培養基上培養２～３ ｄ后轉接于固體除菌培養基上。

１．２．４毛狀根的繼代培養及潮霉素（Ｈｙｇｒ）抗性篩選除菌培養約１０ ｄ后，毛狀根陸續從外植體的傷口邊緣長出。待毛狀根長約５ ｃｍ時剪下，接種到固體除菌培養基上，每２１ ｄ繼代一次，繼代３次，完全除菌后，轉到無抗生素的ＭＳ固體培養基上培養１周，直至毛狀根完全除菌后，再將單克隆毛狀根轉入篩選培養基（ＭＳ＋２５ ｍｇ／Ｌ Ｈｙｇｒ）中進行１６ ｄ的抗性篩選，篩選完成后取每個毛狀根單克隆少量用于ＰＣＲ檢測。

１．２．５毛狀根的ＰＣＲ檢測毛狀根ＤＮＡ提取參照文獻［４］，質粒提取參照文獻［５］。ｒｏｌＣ（６２６ ｂｐ）的引物序列為Ｆ：５′－ＣＴＣＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＡＣＴＣＧＴＣ－３′，Ｒ：５′－ＴＧＣＴＴＣＧＡＧＴＴＡＴＧＧＧＴＡＣＡ－３′；反應條件為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性４０ ｓ，５５ ℃退火４０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３４個循環；７２ ℃延伸７ ｍｉｎ。ｈｙｇｒ（８１２ ｂｐ）引物序列為Ｆ：５′－ＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴＡＣＧＣＣＣＧ

ＡＣＡＧＴＣ－３′，Ｒ：５′－ＣＧＡＴＧＴＡＧＧＡＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡ

ＴＧ－３′［５］；反應條件為：９４ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性４５ ｓ，５５ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個循環；７２ ℃延伸８ ｍｉｎ。ＰＣＲ擴增產物采用１．０％瓊脂糖凝膠（ＧｏｌｄＶｉｅｗ染色）進行電泳檢測（１２０ Ｖ，１００ ｍＡ，２５ ｍｉｎ），電泳結束后在凝膠成像系統下觀察分析（ＵＶ，２６０ ｎｍ）并拍照。

２結果與分析

２．１粘毛黃芩毛狀根的誘導結果

未感染農桿菌的粘毛黃芩外植體在固體除菌培養基上連續培養１月后無生根現象，大部分葉片及子葉逐漸褐化壞死，部分幼莖在切口處產生淡黃色疏松愈傷組織。而感染工程菌Ｃ５８Ｃ１的外植體培養１周后，從其切口處產生少量淡黃色的愈傷組織，２～３ ｄ后愈傷組織上誘導出被白色短根毛的毛狀根；也有少數直接從切口處產生毛狀根（圖１－Ａ、Ｂ、Ｃ）。外植體的類型影響發根農桿菌的感染效率，在子葉、幼莖、葉片三種外植體中，幼莖的誘導效率最高；其次是子葉；葉片易褐化死亡，誘導效率最低（表１）。

２．２粘毛黃芩毛狀根的繼代培養及Ｈｙｇｒ抗性篩選結果

將長約５ ｃｍ的毛狀根切下置于固體除菌培養基，進行除菌培養，直至農桿菌徹底除去。毛狀根可在無外源激素的培養基上自主生長，并且較多分枝和根毛（圖１－Ｄ），共獲得３２個單克隆發根系。然后將單克隆發根系轉入篩選培養基中進行１６ ｄ的抗性篩選，１６ ｄ后單克隆毛狀根生長情況發生分化：９個單克隆發根系分支較多、生長旺盛；２３個單克隆發根系生長緩慢、逐漸褐化壞死。

２．３粘毛黃芩毛狀根的ＰＣＲ檢測

從３２個單克隆發根系中各取少量毛狀根進行ＰＣＲ檢測，３２個單克隆全部含ｒｏｌＣ片段。生長旺盛的９個單克隆含ｈｙｇｒ片段（圖２），褐化死亡的２３個單克隆無ｈｙｇｒ片段。說明Ｈｙｇｒ抗性的獲得是由ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋質粒攜帶的ｈｙｇｒ基因在毛狀根中表達的結果，生長旺盛的９個單克隆是ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋與ｐＲｉＡ４質粒共轉化形成的毛狀根，具有Ｈｙｇｒ抗性，而ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋質粒未轉入的毛狀根單克隆不具Ｈｙｇｒ抗性，因此生長緩慢、逐漸褐化。在３２個單克隆中，ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋質粒與ｐＲｉＡ４質粒的共轉化率達２８．１％。

３討論

粘毛黃芩的幼莖及子葉大部分毛狀根是在切口形成淡黃色的愈傷組織后產生，而葉片外植體不經愈傷組織階段，直接從其切口部分產生根原基，發育成毛狀根。這與Ｒｉ質粒轉化商陸葉柄后不經過愈傷組織階段，直接從其切口產生毛狀根的方式不同［６］。馬鈴薯葉片外植體和塊莖切塊被發根農桿菌感染后則直接產生毛狀根，但其莖段外植體則從形成的愈傷組織上長出毛狀根［７］。可見，發根農桿菌浸染植物細胞后，毛狀根的形態發生方式可因植物種類和感染部位等不同而有所差異。

ｒｏｌ家族的基因是發根農桿菌Ｒｉ質粒上與毛狀根形成密切相關的基因［８］，只要檢測到上述ｒｏｌ家族的基因，就可以確定被檢測的單克隆根系是真正的毛狀根。同時Ｃ５８Ｃ１工程菌攜帶的植物高效表達載體ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋上面攜帶一個粘毛黃芩中沒有的ｈｙｇｒ基因，因此，如果在毛狀根單克隆中同時檢測到ｒｏｌＣ和ｈｙｇｒ兩個基因，就能證明其是ｐＲｉＡ４和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋共轉化的發根單克隆。本研究建立的基于粘毛黃芩毛狀根的遺傳轉化體系，共轉化率達到２８．１％，且ｐＣＡＭＢＩＡ１３０４＋可用于在毛狀根中同時表達多個目的基因，包括粘毛黃芩黃酮類化合物生物合成途徑中的關鍵酶基因，為實現其代謝工程提供了一個技術平臺。

參考文獻：

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