α-半乳糖苷酶法合成α-半乳糖基-β-環糊精的研究

摘要：應用發芽咖啡豆α－半乳糖苷酶法合成α－半乳糖基－β－環糊精，研究其合成工藝。通過Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ設計等方法，得出工藝條件為α－半乳糖苷酶用量７３ ｎｋａｔ，時間２８ ｈ，ｐＨ ６．３，溫度４０ ℃，振蕩速度７５ ｒ／ｍｉｎ，反應體系包括２ ｍＬ醋酸緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ），β－環糊精０．４ ｍｏｌ／Ｌ，蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ。在此條件下，α－半乳糖基－β－環糊精絕對產率為２８．４％，比優化前提高了４１．３％。

關鍵詞：α－半乳糖苷酶；酶法合成；α－半乳糖基－β－環糊精；

中圖分類號：ＴＳ２７３ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）19－4041-03

Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｂｙ α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ

ＳＨＥＮ Ｗａｎｇ－ｙａｎｇ１，ＪＩＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｕ２，ＧＡＯ Ｈｏｎｇ３

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００２３， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ；３ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ－aｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｂｙ α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｏｆ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｃｏｆｆｅｅ ｂｅａｎｓ ｗｅｒｅ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ７３ ｎｋａｔ； Rｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ２８ ｈ； ｐＨ， ６．３； Rｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ４０ ℃； Oｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ ｓｐｅｅｄ， ７５ ｒ／ｍｉｎ； β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ， ０．４ ｍｏｌ／Ｌ； ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ， ０．８ｍｏｌ／Ｌ； ａｎｄ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ （５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）， ２ ｍＬ， Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｗａｓ ２８．４％ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ４１．３％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ before optimization．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ

環糊精（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，常見為β－環糊精）具有內疏水、外親水的特殊性質，在制藥、化工、食品等領域被廣泛地研究及應用。但其溶解性能不佳，制約了進一步的應用研究。改性制備分支環糊精，可以擴大分子親水區域，提高溶解性［１－４］。α－半乳糖基－β－環糊精（α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）是一種分支環糊精，是β－環糊精的衍生物，其具有較高的水溶性，分支上的半乳糖基在動物組織中具有特殊的識別受體，具有廣闊的應用前景［５－７］。前期研究工作采用江南大學食品科學與技術國家重點實驗室自制的發芽咖啡豆α－半乳糖苷酶（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２２）酶法合成得到α－半乳糖基－β－環糊精，并成功地鑒定了其結構。本實驗以β－環糊精和蜜二糖為原料，優化發芽咖啡豆α－半乳糖苷酶法合成α－半乳糖基－β－環糊精的工藝，有利于提高酶法合成的產量和效率，進而指導生產。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試劑發芽咖啡豆α－半乳糖苷酶為江南大學食品科學與技術國家重點實驗室自制［８］；對硝基苯酚－α－半乳糖苷（ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－α－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏ ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ＰＮＰＧ）和蜜二糖購于Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（上海）貿易有限公司；其余試劑均為國產分析純。

１．１．２儀器與設備Ｗａｔｅｒｓ ６００高效液相色譜儀，美國Ｗａｔｅｒｓ公司；Ｄｉｒｅｃｔ－Ｑ３超純水系統，美國Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；Ｄｅｌｔａ３２０ ｐＨ計，梅特勒－托利多儀器有限公司；ＸＷ－８０Ａ漩渦混合器，上海醫科大學儀器廠；８０－２離心機，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；ＨＷ．ＹＳ電子恒溫水浴鍋，浙江舟山海源儀器廠。

１．２方法

１．２．１酶法合成反應將β－環糊精、蜜二糖和發芽咖啡豆α－半乳糖苷酶溶解于２ ｍＬ醋酸緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ ６．０）中，使反應緩沖液中包括β－環糊精 ０．４ ｍｏｌ／Ｌ、蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ、α－半乳糖苷酶５０ ｎｋａｔ。由于水溶性較差，混合體系中的β－環糊精不能完全溶解，呈現過飽和狀態，將盛有反應緩沖液的容器置于恒溫振蕩器中，進行酶法合成反應，反應條件為３０ ℃，１００ ｒ／ｍｉｎ反應３６ ｈ。反應結束后煮沸１０ ｍｉｎ，使α－半乳糖苷酶充分滅活。滅活后的混合液５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心 ５ ｍｉｎ，取上清液［８，９］。

１．2．２α－半乳糖基－β－環糊精的高效液相色譜分析及制備①高效液相色譜分析酶法合成反應后的上清液。泵，Ｗａｔｅｒｓ ６００；色譜柱，Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ａｓｐ－１－ＮＨ２柱（４．６ ｍｍ×２００ ｍｍ）；流動相，７５％乙腈（體積分數）；檢測器，Ｗａｔｅｒｓ ２４１０差示折光檢測器（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｍｏｎｉｔｏｒ）；柱溫，３０ ℃；流速，１.0 ｍＬ／ｍｉｎ；進樣量，２０ μＬ。②采用制備型高效液相色譜對上清液進行分離純化，對應特征吸收峰收集各組分，得到所需產品。泵，Ｗａｔｅｒｓ １５２５；色譜柱，ＳｕｎＦｉｒｅＴＭＯＢＤＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８柱（５ μｍ，１９ ｍｍ×１５０ ｍｍ）；檢測器，ＳＥＤＥＸ７５ 蒸發光散射檢測器（Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）；進樣量，５００ μＬ；柱溫，３５ ℃；流動相，１０％甲醇（體積分數）；流速８．０ ｍＬ／ｍｉｎ；分流比為１０∶１。分別計算α－半乳糖基－β－環糊精的絕對產率和相對產率［１０］：絕對產率＝合成α－半乳糖基－β－環糊精的量／起始反應液中溶解的β－環糊精的量；相對產率＝各種工藝條件下α－半乳糖基－β－環糊精的產率／１．2．１條件下α－半乳糖基－β－環糊精的產率。

１．2．３初始工藝參數的確定在響應面優化試驗前，對初始的工藝參數進行前期試驗和處理。針對１．2．１中的酶法合成反應工藝參數，通過單因素試驗確定酶法合成實驗的多個影響因素及其參數；通過Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ試驗篩選出酶用量、時間和ｐＨ等主要影響因素；通過最陡爬坡法逼近此３個主要因素參數的最佳響應區域。前期的試驗結果為：酶用量為７５ ｎｋａｔ，時間為２４ ｈ，ｐＨ為６．５。其他條件為：溫度４０ ℃，振蕩速度７５ ｒ／ｍｉｎ，底物濃度為蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ，β－環糊精０．４ ｍｏｌ／Ｌ。

１．2．４響應面試驗設計與統計分析［１１，１２］響應面分析試驗設計和統計分析均采用Ｍｉｎｉｔａｂ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｒｅｌｅａｓｅ １３．３２ （Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）軟件執行，采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ試驗設計，對酶用量、時間和ｐＨ這３個因素，分別取預實驗得到的數值作為中間值，向下和向上各取一個值，構成３個水平（表１）。

２結果與分析

２．1響應面分析

通過ＭｉｎｉＴａｂ軟件對響應面試驗結果（表２）進行分析，可以得到關于α－半乳糖基－β－環糊精相對產率（Ｙ）的擬合三元二次方程：Ｙ＝－１ ７１３．１３０＋８．５１７Ｚ１－３．２４０Ｚ２＋５００．２５０Ｚ３－０．０４７Ｚ１２－０．０５４Ｚ２２－３９．０Ｚ３＋０．０２０ ８Ｚ１Ｚ２－０．３６７Ｚ１Ｚ３＋０．７５０Ｚ２Ｚ３。用Ｆ－檢驗驗證以上方程的顯著性（表３），Ｐ＜０．０１，表明因變量與自變量之間的線性關系極顯著。相關系數Ｒ為０．９８５，失擬項不顯著，說明該模型能夠很好地描述試驗結果。方程的校正決定系數Ｒ２ａｄｊ為０．９２０，表明影響相對產率的變異大約有９２％分布在所研究的３個關鍵因子中。

響應面和等高線見圖１。從圖中可以看出，時間、ｐＨ和酶用量及其交互作用對α－半乳糖基－β－環糊精的相對產率的影響非常明顯。

２．2模型驗證實驗及與未優化值的比較

對回歸方程分別求一階偏導等于零，得到最佳相對產率為１３６．９９％，各因素分別為α－半乳糖苷酶的酶用量７２．６１４ ｎｋａｔ（實際取值７３ ｎｋａｔ），時間２８．１５１ ｈ（實際取值２８ ｈ），ｐＨ ６．３４２７４（實際取值ｐＨ ６．３）。在此工藝條件下進行重復實驗，與模型方程的預測值進行對比，并與已報道的工藝條件［５］（酶用量５０ ｎｋａｔ，時間３６ ｈ，ｐＨ ６．０，溫度３０ ℃，振蕩速度１００ ｒ／ｍｉｎ，β－環糊精０．４ ｍｏｌ／Ｌ，蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ）下所獲得的α－半乳糖基－β－環糊精相對產率進行比較。優化條件下相對產率為（１３４．０±４．６）％，絕對產量為２８．４％，未優化條件下相對產率為（１００．０±２．２）％，絕對產率為２０．１％。通過ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ７．５軟件分析，優化條件與未優化條件下的產率存在顯著差異（Ｐ＜０．０５），說明通過優化工藝提高產量的效果是顯著的，優化后的絕對產率提高了４１．３％。

３結論

在優化工藝條件下通過發芽咖啡豆α－半乳糖苷酶制備α－半乳糖基－β－環糊精，反應結束后采用制備型高效液相色譜分離得到α－半乳糖基－β－環糊精，絕對產率為２８．４％。優化后的工藝條件為：發芽咖啡豆α－半乳糖苷酶的酶用量７３ ｎｋａｔ，時間２８ ｈ，ｐＨ ６．３，溫度４０ ℃，振蕩速度７５ ｒ／ｍｉｎ，β－環糊精０．４ ｍｏｌ／Ｌ，蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ。

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