α-半乳糖苷酶法合成α-半乳糖基-β-環(huán)糊精的研究

摘要：應(yīng)用發(fā)芽咖啡豆α－半乳糖苷酶法合成α－半乳糖基－β－環(huán)糊精，研究其合成工藝。通過(guò)Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ設(shè)計(jì)等方法，得出工藝條件為α－半乳糖苷酶用量７３ ｎｋａｔ，時(shí)間２８ ｈ，ｐＨ ６．３，溫度４０ ℃，振蕩速度７５ ｒ／ｍｉｎ，反應(yīng)體系包括２ ｍＬ醋酸緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ），β－環(huán)糊精０．４ ｍｏｌ／Ｌ，蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ。在此條件下，α－半乳糖基－β－環(huán)糊精絕對(duì)產(chǎn)率為２８．４％，比優(yōu)化前提高了４１．３％。

關(guān)鍵詞：α－半乳糖苷酶；酶法合成；α－半乳糖基－β－環(huán)糊精；

中圖分類(lèi)號(hào)：ＴＳ２７３ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０11）19－4041-03

Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α－Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｂｙ α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ

ＳＨＥＮ Ｗａｎｇ－ｙａｎｇ１，ＪＩＮ Ｚｈｅｎｇ－ｙｕ２，ＧＡＯ Ｈｏｎｇ３

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００２３， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ；３ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ－aｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｂｙ α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｏｆ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｃｏｆｆｅｅ ｂｅａｎｓ ｗｅｒｅ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ７３ ｎｋａｔ； Rｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ２８ ｈ； ｐＨ， ６．３； Rｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ４０ ℃； Oｓｃｉｌｌａｔｏｒｙ ｓｐｅｅｄ， ７５ ｒ／ｍｉｎ； β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ， ０．４ ｍｏｌ／Ｌ； ｍｅｌｉｂｉｏｓｅ， ０．８ｍｏｌ／Ｌ； ａｎｄ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ （５０ ｍｍｏｌ／Ｌ）， ２ ｍＬ， Ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ ｗａｓ ２８．４％ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ４１．３％ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ before optimization．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ； α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ

環(huán)糊精（Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，常見(jiàn)為β－環(huán)糊精）具有內(nèi)疏水、外親水的特殊性質(zhì)，在制藥、化工、食品等領(lǐng)域被廣泛地研究及應(yīng)用。但其溶解性能不佳，制約了進(jìn)一步的應(yīng)用研究。改性制備分支環(huán)糊精，可以擴(kuò)大分子親水區(qū)域，提高溶解性［１－４］。α－半乳糖基－β－環(huán)糊精（α－ｇａｌａｃｔｏｓｙｌ－β－ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）是一種分支環(huán)糊精，是β－環(huán)糊精的衍生物，其具有較高的水溶性，分支上的半乳糖基在動(dòng)物組織中具有特殊的識(shí)別受體，具有廣闊的應(yīng)用前景［５－７］。前期研究工作采用江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制的發(fā)芽咖啡豆α－半乳糖苷酶（α－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．２２）酶法合成得到α－半乳糖基－β－環(huán)糊精，并成功地鑒定了其結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)以β－環(huán)糊精和蜜二糖為原料，優(yōu)化發(fā)芽咖啡豆α－半乳糖苷酶法合成α－半乳糖基－β－環(huán)糊精的工藝，有利于提高酶法合成的產(chǎn)量和效率，進(jìn)而指導(dǎo)生產(chǎn)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試劑發(fā)芽咖啡豆α－半乳糖苷酶為江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制［８］；對(duì)硝基苯酚－α－半乳糖苷（ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－α－Ｄ－ｇａｌａｃｔｏ ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ，ＰＮＰＧ）和蜜二糖購(gòu)于Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（上海）貿(mào)易有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

１．１．２儀器與設(shè)備Ｗａｔｅｒｓ ６００高效液相色譜儀，美國(guó)Ｗａｔｅｒｓ公司；Ｄｉｒｅｃｔ－Ｑ３超純水系統(tǒng)，美國(guó)Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司；Ｄｅｌｔａ３２０ ｐＨ計(jì)，梅特勒－托利多儀器有限公司；ＸＷ－８０Ａ漩渦混合器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；８０－２離心機(jī)，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；ＨＷ．ＹＳ電子恒溫水浴鍋，浙江舟山海源儀器廠。

１．２方法

１．２．１酶法合成反應(yīng)將β－環(huán)糊精、蜜二糖和發(fā)芽咖啡豆α－半乳糖苷酶溶解于２ ｍＬ醋酸緩沖液（５０ ｍｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ ６．０）中，使反應(yīng)緩沖液中包括β－環(huán)糊精 ０．４ ｍｏｌ／Ｌ、蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ、α－半乳糖苷酶５０ ｎｋａｔ。由于水溶性較差，混合體系中的β－環(huán)糊精不能完全溶解，呈現(xiàn)過(guò)飽和狀態(tài)，將盛有反應(yīng)緩沖液的容器置于恒溫振蕩器中，進(jìn)行酶法合成反應(yīng)，反應(yīng)條件為３０ ℃，１００ ｒ／ｍｉｎ反應(yīng)３６ ｈ。反應(yīng)結(jié)束后煮沸１０ ｍｉｎ，使α－半乳糖苷酶充分滅活。滅活后的混合液５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心 ５ ｍｉｎ，取上清液［８，９］。

１．2．２α－半乳糖基－β－環(huán)糊精的高效液相色譜分析及制備①高效液相色譜分析酶法合成反應(yīng)后的上清液。泵，Ｗａｔｅｒｓ ６００；色譜柱，Ｈｙｐｅｒｓｉｌ Ａｓｐ－１－ＮＨ２柱（４．６ ｍｍ×２００ ｍｍ）；流動(dòng)相，７５％乙腈（體積分?jǐn)?shù)）；檢測(cè)器，Ｗａｔｅｒｓ ２４１０差示折光檢測(cè)器（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ ｍｏｎｉｔｏｒ）；柱溫，３０ ℃；流速，１.0 ｍＬ／ｍｉｎ；進(jìn)樣量，２０ μＬ。②采用制備型高效液相色譜對(duì)上清液進(jìn)行分離純化，對(duì)應(yīng)特征吸收峰收集各組分，得到所需產(chǎn)品。泵，Ｗａｔｅｒｓ １５２５；色譜柱，ＳｕｎＦｉｒｅＴＭＯＢＤＴＭ Ｐｒｅｐ Ｃ１８柱（５ μｍ，１９ ｍｍ×１５０ ｍｍ）；檢測(cè)器，ＳＥＤＥＸ７５ 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）；進(jìn)樣量，５００ μＬ；柱溫，３５ ℃；流動(dòng)相，１０％甲醇（體積分?jǐn)?shù)）；流速８．０ ｍＬ／ｍｉｎ；分流比為１０∶１。分別計(jì)算α－半乳糖基－β－環(huán)糊精的絕對(duì)產(chǎn)率和相對(duì)產(chǎn)率［１０］：絕對(duì)產(chǎn)率＝合成α－半乳糖基－β－環(huán)糊精的量／起始反應(yīng)液中溶解的β－環(huán)糊精的量；相對(duì)產(chǎn)率＝各種工藝條件下α－半乳糖基－β－環(huán)糊精的產(chǎn)率／１．2．１條件下α－半乳糖基－β－環(huán)糊精的產(chǎn)率。

１．2．３初始工藝參數(shù)的確定在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)前，對(duì)初始的工藝參數(shù)進(jìn)行前期試驗(yàn)和處理。針對(duì)１．2．１中的酶法合成反應(yīng)工藝參數(shù)，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定酶法合成實(shí)驗(yàn)的多個(gè)影響因素及其參數(shù)；通過(guò)Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ試驗(yàn)篩選出酶用量、時(shí)間和ｐＨ等主要影響因素；通過(guò)最陡爬坡法逼近此３個(gè)主要因素參數(shù)的最佳響應(yīng)區(qū)域。前期的試驗(yàn)結(jié)果為：酶用量為７５ ｎｋａｔ，時(shí)間為２４ ｈ，ｐＨ為６．５。其他條件為：溫度４０ ℃，振蕩速度７５ ｒ／ｍｉｎ，底物濃度為蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ，β－環(huán)糊精０．４ ｍｏｌ／Ｌ。

１．2．４響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析［１１，１２］響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析均采用Ｍｉｎｉｔａｂ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ Ｒｅｌｅａｓｅ １３．３２ （Ｍｉｎｉｔａｂ Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）軟件執(zhí)行，采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)酶用量、時(shí)間和ｐＨ這３個(gè)因素，分別取預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)值作為中間值，向下和向上各取一個(gè)值，構(gòu)成３個(gè)水平（表１）。

２結(jié)果與分析

２．1響應(yīng)面分析

通過(guò)ＭｉｎｉＴａｂ軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表２）進(jìn)行分析，可以得到關(guān)于α－半乳糖基－β－環(huán)糊精相對(duì)產(chǎn)率（Ｙ）的擬合三元二次方程：Ｙ＝－１ ７１３．１３０＋８．５１７Ｚ１－３．２４０Ｚ２＋５００．２５０Ｚ３－０．０４７Ｚ１２－０．０５４Ｚ２２－３９．０Ｚ３＋０．０２０ ８Ｚ１Ｚ２－０．３６７Ｚ１Ｚ３＋０．７５０Ｚ２Ｚ３。用Ｆ－檢驗(yàn)驗(yàn)證以上方程的顯著性（表３），Ｐ＜０．０１，表明因變量與自變量之間的線性關(guān)系極顯著。相關(guān)系數(shù)Ｒ為０．９８５，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果。方程的校正決定系數(shù)Ｒ２ａｄｊ為０．９２０，表明影響相對(duì)產(chǎn)率的變異大約有９２％分布在所研究的３個(gè)關(guān)鍵因子中。

響應(yīng)面和等高線見(jiàn)圖１。從圖中可以看出，時(shí)間、ｐＨ和酶用量及其交互作用對(duì)α－半乳糖基－β－環(huán)糊精的相對(duì)產(chǎn)率的影響非常明顯。

２．2模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)及與未優(yōu)化值的比較

對(duì)回歸方程分別求一階偏導(dǎo)等于零，得到最佳相對(duì)產(chǎn)率為１３６．９９％，各因素分別為α－半乳糖苷酶的酶用量７２．６１４ ｎｋａｔ（實(shí)際取值７３ ｎｋａｔ），時(shí)間２８．１５１ ｈ（實(shí)際取值２８ ｈ），ｐＨ ６．３４２７４（實(shí)際取值ｐＨ ６．３）。在此工藝條件下進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，與模型方程的預(yù)測(cè)值進(jìn)行對(duì)比，并與已報(bào)道的工藝條件［５］（酶用量５０ ｎｋａｔ，時(shí)間３６ ｈ，ｐＨ ６．０，溫度３０ ℃，振蕩速度１００ ｒ／ｍｉｎ，β－環(huán)糊精０．４ ｍｏｌ／Ｌ，蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ）下所獲得的α－半乳糖基－β－環(huán)糊精相對(duì)產(chǎn)率進(jìn)行比較。優(yōu)化條件下相對(duì)產(chǎn)率為（１３４．０±４．６）％，絕對(duì)產(chǎn)量為２８．４％，未優(yōu)化條件下相對(duì)產(chǎn)率為（１００．０±２．２）％，絕對(duì)產(chǎn)率為２０．１％。通過(guò)ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ７．５軟件分析，優(yōu)化條件與未優(yōu)化條件下的產(chǎn)率存在顯著差異（Ｐ＜０．０５），說(shuō)明通過(guò)優(yōu)化工藝提高產(chǎn)量的效果是顯著的，優(yōu)化后的絕對(duì)產(chǎn)率提高了４１．３％。

３結(jié)論

在優(yōu)化工藝條件下通過(guò)發(fā)芽咖啡豆α－半乳糖苷酶制備α－半乳糖基－β－環(huán)糊精，反應(yīng)結(jié)束后采用制備型高效液相色譜分離得到α－半乳糖基－β－環(huán)糊精，絕對(duì)產(chǎn)率為２８．４％。優(yōu)化后的工藝條件為：發(fā)芽咖啡豆α－半乳糖苷酶的酶用量７３ ｎｋａｔ，時(shí)間２８ ｈ，ｐＨ ６．３，溫度４０ ℃，振蕩速度７５ ｒ／ｍｉｎ，β－環(huán)糊精０．４ ｍｏｌ／Ｌ，蜜二糖０．８ ｍｏｌ／Ｌ。

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