不同光照及儲藏溫度對水杉種子萌發及酶活性的影響

摘要：以水杉（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅ）種子為材料，設置全光照、全黑暗和光暗交替（各１２ ｈ／ｄ）３種不同光照和室溫、４ ℃干藏的儲藏條件，研究這些條件下水杉種子的萌發特性、酶活性及可溶性糖變化。結果表明，在３種光照處理下，水杉種子最適宜的萌發條件為全黑暗處理。在水杉種子儲藏過程中，４ ℃干藏條件下的種子ＰＯＤ活性始終高于室溫干藏；４ ℃干藏條件下的種子ＳＯＤ同工酶變化幅度相對于室溫儲藏條件小，而兩種儲藏溫度下種子的可溶性糖變化幅度都較小，所以４ ℃是比較適合水杉種子儲藏的溫度。

關鍵詞：水杉種子；儲藏條件；發芽率；酶活性

中圖分類號：Ｓ７９１．３５；Ｑ９４５．３４ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）19－3980-04

Influence of Different Light and Storage Temperature on Germination Rate and

Enzyme Activities of Metasequoia glyptostroboide Seeds

ＪＩＮＧ Ｄａｎ－ｌｏｎｇ１，ＬＩＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ｗｅｉ１，ＷＡＮＧ Ｙｕ－ｂｉｎｇ１，ＷＡＮＧ Ｊｉｎｇ２，ＺＨＡＮＧ Ｄｅ－ｃｈｕｎ１

（１． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｃｈａｎｇ ４４３００２， Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ；２． Shennongjia Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｄｉｏｎ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｕｙｕ，４４２４００，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅ） ｓｅｅｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｒｅｅ ｋｉｎｄ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ （ｆｕｌｌ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ， ｆｕｌｌ ｄａｒｋｎｅｓｓ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｄａｒｋｎｅｓｓ ｅｖｅｒｙ １２ ｈｏｕｒｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ａｎｄ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ （ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｒｅｔｕｒｅ ａｎｄ ４ ℃，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）． Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ mｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｅｄｓ’ ｖｉｇｏｒ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｆｕｌｌ ｄａｒｋｎｅｓｓ waｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｌｉｇｈｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ mｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｅｄｓ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ among ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｌｉｇｈｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ． Ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｕｎｄｅｒ ４ ℃ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ mｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｅｄｓ ａｔ ４ ℃ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｓｍａｌｌｅｒ under ４ ℃ ｔｈａｎ ｔｈａｔ under ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． Ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒ ｉｎ mｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｅｄｓ ｗｅｒｅ ｓｍａｌｌｅｒ ａｔ ｂｏｔｈ ｔｗｏ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｉｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ， ４ ℃ ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ waｓ ｍｏｒｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ mｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｅｄｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａｇｌｙ ｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ ｓｅｅｄ； ｓｔｏｒａｇｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ； ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ； ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ

水杉（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ Ｈｕ ｅｔ Ｃｈｅｎｇ）屬杉科（Ｔａｘｏｄｉａｃｅａｅ）水杉屬（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ）植物，中國特有孑遺珍貴樹種，被列為國家一級保護植物，素有“活化石”之稱。水杉在中生代白堊紀及新生代曾廣泛分布于北半球，第四紀冰期以后，水杉屬的其他種類全部滅絕，僅存水杉一種。水杉野生種僅分布于湖北利川、四川石柱和湖南龍山，對古植物、古氣候、古地理和地質學以及裸子植物系統發育的研究均有重要意義［１］。水杉樹干通直挺拔，生長快，葉色翠綠，秋后葉色金黃，是庭院觀賞和亞熱帶地區平原綠化的優良樹種，也是速生用材樹種［２，３］。

目前，對水杉的研究主要集中在其地理分布、系統演化地位、群落生態學以及遺傳多樣性等方面［４－６］。由于水杉種子天然發芽率低，種子向幼苗的轉型率低，自然更新困難，加上人為破壞等原因，致使野生水杉數量急劇下降而處于瀕危狀態［７，８］。試驗針對水杉種子萌發困難的突出問題，旨在通過不同光照條件及儲藏溫度對水杉種子萌發和酶活性的影響，探索水杉種子合適的儲藏和萌發條件，進而為挽救瀕危植物水杉提供一定的科學依據。

１材料與方法

１．１材料

水杉球果于２００８年１０月采自湖北利川水杉壩，自然風干裂開后將種子挑出。

１．２方法

１．２．１不同光照處理對種子萌發的影響以脫脂紗布作為發芽床，每個培養皿中鋪兩層脫脂紗布，包好滅菌待用。分別置于全光照、全黑暗、光照黑暗交替條件下（光照黑暗交替處理的光照時間為１２ ｈ／ｄ，以日光燈作為光源）于（２５±２）℃培養。每處理３個重復，每個重復播種１００粒種子。

統計并計算其發芽率，發芽率＝１５ ｄ內發芽的種子數／供試種子總數×１００％。

１．２．２室溫和４ ℃干藏條件對水杉種子萌發的影響經室溫和４ ℃干藏條件處理的水杉種子，每１５ ｄ取樣一次，用于萌發試驗。將取樣的水杉種子于２５ ℃水中浸泡１２ ｈ，除去漂浮的種子。以鋪濕紗布的培養皿為發芽床，每個培養皿中播種１００粒水杉種子。每個處理３次重復。在 （２５±２）℃的培養箱中進行全黑暗處理，觀察記錄。對室溫和４ ℃干藏條件下材料每隔１５ ｄ進行取樣，每次取樣品１０份，每份０．３ ｇ。經液氮速凍后，置于－７０ ℃超低溫冰箱中保存備用。

１．２．３酶液的制備用取自不同處理條件下的樣品０．３ ｇ，加入０．１ ｇ聚乙烯吡咯烷酮，２．０ ｍＬ ｐＨ值７．８的磷酸緩沖液，于冰上研磨成勻漿，分裝于２ ｍＬ的離心管中，冰浴上靜置１～２ ｈ。４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心２０ ｍｉｎ，重復３次，取上清液，得到酶液，－２０ ℃冰箱保存備用。

１．２．４ＰＯＤ活性的測定采用聯苯胺比色法［９］測定 ＰＯＤ活性。取稀釋１０倍的酶液０．５ ｍＬ，加入１ ｍＬ聯苯胺醋酸－醋酸鈉緩沖溶液，３０ ℃水浴保溫５ ｍｉｎ。測定時加０．５ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ的Ｈ２Ｏ２，立即搖勻， 并轉入比色皿中，于波長５８０ ｎｍ處測定吸光度，從加入Ｈ２Ｏ２起計時，每１５ ｓ讀數一次。按下式計算樣品中ＰＯＤ活性。

Ｅ＝△ＯＤ（１５－４５）×２×稀釋倍數／１ ０００。

１．２．５ＳＯＤ活性的測定采用氮藍四唑（ＮＢＴ）法［１０］測定ＳＯＤ的活性。取４支５ ｍＬ的指形管，其中３支為測定管，１支為對照管，按表１加入各溶液。

混勻后將對照管置暗處，其他各管于４ ０００ ｌｘ日光燈下反應２ ｍｉｎ，之后用黑布終止反應。反應結束后以不照光的對照管做空白，立即將測定管置于５６０ ｎｍ處測定其他各管的吸光度。已知ＳＯＤ活性單位以抑制ＮＢＴ光化還原的５０％為一個酶活性單位表示，按下式計算ＳＯＤ活性。

ＳＯＤ總活性＝（ODＣＫ－ODＥ）×Ｖ×２／ODＣＫ×Ｗ×ＶＴ

１．２．６可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法［１０］。?。保敝В?ｍＬ的ＥＰ管從０～１０分別編號，按表２加入溶液和ＰＢＳ。按順序向ＥＰ管中加入０．１ ｍＬ蒽酮乙酸乙酯試劑和１ ｍＬ濃硫酸，充分振蕩，在沸水中保溫１ ｍｉｎ。取出自然冷卻，以空白管做對照。在６３０ ｎｍ下測吸光度。以吸光度為縱坐標，糖含量為橫坐標，繪制標準曲線。取０．４ ｍＬ稀釋２００倍的酶液，加０．１ ｍＬ蒽酮乙酸乙酯和１ ｍＬ濃硫酸，充分振蕩后，在沸水中保溫１ ｍｉｎ，取出自然冷卻后測樣品的吸光度。

２結果與分析

２．１不同光照及室溫、４ ℃干藏條件對水杉種子萌發的影響

２．１．１光照條件對水杉種子萌發的影響水杉種子在播種４ ｄ后就開始萌發，說明水杉種子沒有明顯的休眠特性。如表３所示，水杉種子在全光照、光暗交替和全黑暗處理條件下的發芽率分別為１４．６７％、１４．３３％和１６．３３％，發芽率都較低。由此可見，水杉種子本身的活力比較低，光照對水杉新鮮種子的萌發有一定的抑制作用，全黑暗條件有利于水杉種子的萌發。

２．１．２室溫、４ ℃干藏條件對水杉種子萌發的影響室溫、４ ℃干藏條件對水杉種子萌發的影響見圖１。從圖１可以看出，４ ℃儲藏條件下的水杉發芽率比室溫儲藏條件下的高。兩者之間的最大差值可達４．２５個百分點。在同樣經歷了萌發低谷后，兩種儲藏條件的發芽率都有所回升，其中室溫儲藏條件下的水杉種子比新鮮成熟種子的發芽率低５．０８個百分點，而在４ ℃儲藏條件的水杉種子只比新鮮成熟種子的發芽率低０．８３個百分點。由此可知，４ ℃儲藏條件相對于室溫儲藏條件更適合水杉種子的儲藏。

２．２酶活性的測定結果

２．２．１ＰＯＤ活性的測定結果室溫儲藏和４ ℃儲藏條件下，水杉種子的ＰＯＤ活性見圖２。從圖２可以看出，兩種儲藏條件下水杉種子的ＰＯＤ活性均比較低，說明對細胞的保護作用都比較弱。同時在儲藏過程中，４ ℃儲藏條件下的水杉種子ＰＯＤ活性經歷了先降后升、再降再升的一個過程，而室溫儲藏條件下的水杉種子ＰＯＤ活性很快就降至最低。這種現象與種子的儲藏條件有密切的聯系，說明４ ℃儲藏條件比室溫儲藏條件更適合水杉種子的儲藏。

２．２．２ＳＯＤ活性的測定結果ＳＯＤ是需氧生物中普遍存在的一種酶，它可以控制脂質氧化，減少膜系統傷害，具有提高作物品質和增強作物抗逆性的作用［１１］。在室溫儲藏條件下，ＳＯＤ總活性的差異比較大，在１６８．７５～９８７．３０ U/g（圖３）。在４ ℃儲藏條件下SOD活性的變化為逐漸減小，變化幅度也相對于室溫儲藏條件的小。這表明水杉種子在４ ℃儲藏條件下其膜系統受到的破壞小，所以相對于室溫儲藏條件，４ ℃儲藏條件更適合水杉種子儲藏。

２．３可溶性糖含量的測定結果

儲藏過程中不同儲藏條件的水杉種子可溶性糖的含量變化見圖４。從圖４可以看出，兩者都出現了先上升后下降、再上升的一個變化過程，同時幅度較小。但是４ ℃儲藏條件下的可溶性糖含量總體上比室溫儲藏條件下的低。這是由于在室溫條件下，種子容易失去水分，為了適應外界環境，可溶性糖含量有所升高。結合水杉種子的吸水率，可知水杉種子對水分含量較為敏感。在種子萌發的階段，需要充足的水分，不然會影響種子的發芽率。

３小結

試驗中觀察到水杉種子在播種后４ ｄ后即可萌發，表明水杉種子無休眠特性，同時水杉種子是一種光敏感種子，所以水杉種子在全黑暗條件下萌發更好。針對不同溫度對水杉種子萌發影響的研究發現，低溫可以明顯降低水杉種子的發芽率［１２］。而種子質量的好壞是影響種群未來命運的關鍵因子［１３］。

試驗結果表明，４ ℃儲藏條件下水杉種子的發芽率比室溫儲藏條件的高，室溫儲藏條件下的ＰＯＤ比４ ℃條件下儲藏的低。這說明ＰＯＤ對水杉種子的萌發起到了一定的促進作用，同時也表明４ ℃更適合水杉種子的儲藏。有研究表明，溫度對水杉種子萌發時體內３種抗氧化酶的活性都有影響，并且抗性酶活性越高，種子發芽率越高［１２］。另有研究表明，在低溫條件下，扁蓿豆幼苗葉片內ＰＯＤ酶活性會相應提高以適應低溫脅迫，減輕低溫傷害［１４］。

ＳＯＤ是植物細胞中最重要的清除活性氧的酶類之一，其作用是使具有潛在危險的超氧自由基變成水和氧，減輕超氧自由基對細胞的傷害［１５，１６］。在４ ℃儲藏條件下，水杉種子中ＳＯＤ含量先上升，而后逐漸降低；而在室溫儲藏后，隨著室溫的變化，ＳＯＤ含量出現了無規則變化，這說明ＳＯＤ對溫度變化的反應比較靈敏。但是在ＳＯＤ偏高時，水杉種子的發芽率還是比較低。這可能與室溫的變化無?；蛘呤牵樱希膶λ挤N子萌發的促進作用較弱有關。

兩種儲藏條件下，水杉種子中可溶性糖的含量較低、變化的幅度相對較小，與種子發芽率的變化趨勢不一致。但許多研究表明，糖是植物生長發育和基因表達的重要調節因子，它不僅是能量來源和結構物質，而且在信號轉導中具有類似激素的初級信使作用，對植物抗逆性及儲存過程起重要作用［１７－１９］。對于哪種物質對水杉種子的萌發起主要作用還需要進一步研究。

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