一種黃病毒引起鴨產蛋下降的診斷報告

摘要：２０１０年以來湖北省部分地區蛋鴨群出現了嚴重的產蛋下降以及持續性死亡，對發病鴨進行了病理剖檢以及病毒的ＰＣＲ鑒定。其中用ＲＴ－ＰＣＲ檢測鴨黃病毒為陽性，禽流感病毒、新城疫病毒和減蛋綜合征病毒均為陰性。對ＰＣＲ擴增的鴨黃病毒目的片段進行回收測序，將測序結果與黃病毒屬的7個不同的病毒群進行序列比對，表明該病毒與黃病毒科黃病毒屬恩塔亞病毒群的坦布蘇病毒ＴＨＣＡｒ株和ｓｉｔｉａｗａｎ株同源性較高，分別為８９．３％和 ８７．１％，具有較近的遺傳進化關系。

關鍵詞：蛋鴨；產蛋下降；鴨黃病毒；ＲＴ－ＰＣＲ；序列分析

中圖分類號：Ｓ８５８．３２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０11）19－4010-04

Ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ a Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ Ｃａｕｓｉｎｇ Ｄｕｃｋ Ｅｇｇ Ｄｒｏｐｓ

ＺＨＡＮＧ Ｒｏｎｇ－ｒｏｎｇ，ＷＥＮ Ｇｕｏ－ｙｕａｎ，ＬＵＯ Ｑｉｎｇ－ｐｉｎｇ，YANG Jun，ＷＡＮＧ Ｈｏｎｇ－lｉｎ，ＬＵＯ Ｌｉｎｇ，

ＡＩ Ｄｉ－ｙｕｎ，ＳＨＡＯ Ｈｕａ－ｂｉｎ

（Ｉｎｓｉｔｕtｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｈｕｂｅｉ Academy of Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅs / Ｈｕｂｅｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｗｕｈａｎ ４３００６４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｄｉｓｅａｓｅ causing severe egg drop ａｎｄ ｄｕｃｋ ｄｅａｔｈ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｔ ｍａｎｙ ｂｒｅｅｄｅｒ ｄｕｃｋ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｓｉｎｃｅ ２０１０． Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ， ｂｕｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｏ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ， Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｅｇｇ－ｄｒｏｐ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ． Ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｓｔｒａｉｎ ＴＨＣＡｒ ａｎｄ ｓｉｔｉａｗａｎ ｗｈｉｃｈ ｓｕｂｍｉｔｅｄ ｔｏ Ｎｔａｙａ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ ｏｆ Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ ｇｅｎｕｓ ｉｎ Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ ｆａｍｉｌｙ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗａｓ ８９．３％ ａｎｄ ８７．１％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄs： ｌａｙｉｎｇ ｄｕｃｋｓ； decrease of egg laying； ｄｕｃｋ ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ； ＲＴ－ＰＣＲ； ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ

２０１０年以來湖北省部分地區大型養鴨場飼養的種鴨和蛋鴨出現了嚴重的產蛋下降，其中有

６ ０００多只蛋鴨出現不同程度的發病，產蛋率從９０％～９５％下降到４０％～４５％，并且死亡三四百只，死亡率達到６％左右，造成了巨大的經濟損失。臨床剖檢可見其卵巢嚴重充血、出血；肺臟有肉變，并有很多白色圓形小結節；脾臟充血腫大，而腺胃、肌胃及其交界處沒有出血點，較正常。對發病鴨進行了相關病毒的病原學檢測，檢測出鴨黃病毒陽性。根據臨床剖檢情況，發病鴨卵巢充血、出血嚴重，并且從鴨病變的卵巢樣品中擴增出陽性病毒，因此暫將該病毒命名為鴨出血性卵巢炎病毒（Dｕｃｋ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｏｖａｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＤＨＯＶ），現將相關研究結果報道如下，為獸醫工作者臨床診斷此病提供一定的依據。

１材料與主要試劑

１．１材料

發病種蛋鴨的肺臟、腦、輸卵管、卵泡等組織。

１．２主要試劑

Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ａｇａｒ （ＴＳＡ）固體培養基，購自ＤｉｆｃｏＴＭ公司，按說明書配制后使用前加入新生牛血清至終濃度為１０％；ＡＭＶ反轉錄酶（Ｐｒｏｇｅｍａ）、ＲＮＡ酶抑制劑（Ｐｒｏｇｅｍａ）、ＤＥＰＣ（Ｓｉｇｍａ）、ｄＮＴＰｓ購自寶生物工程（大連）有限公司；Ｔｒａｎｓ 2k plus DNA Ｍａｒｋｅｒ購于北京全式金生物科技有限公司；Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ購自上海華舜生物技術有限公司；Agarose Gel DNA Extraction Kit購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司氯仿等試劑為分析純試劑。

２試驗方法

２．１細菌分離

無菌采取病（死）蛋鴨的肝臟、心血和腦組織，接種ＴＳＡ固體平板、普通營養瓊脂和麥康凱瓊脂等培養基，置３７ ℃溫箱培養過夜。

２．２引物設計和合成

參照Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ＮＳ５ 基因序列設計了兩對引物。第一對引物為上游引物ＤＦＶ－Ｕ１：５′－ＡＧＡＧＣＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＡＧ－３′，下游引物ＤＦＶ－Ｄ１：５′－ＧＡＴＡＡＧＣＴＧＧＡＣＧＣＡＣＡＧＡＴＴＣＧ－３′，目的片段為４５０ｂｐ。第二對引物為上游引物ＤＦＶ－Ｕ２：５′－ＴＧＣＴＣＴＣＡＡＣＡＣＴＴＴＣＡＣＧＡＡＴＣＴＧ－３′，下游引物ＤＦＶ－Ｄ２：５′－ＧＣＡＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＴＧＧＴＧＴＧＡＡＣ－３′，目的片段為３３５ ｂｐ。由上海生工生物工程有限公司合成。

禽流感病毒（Ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ，ＡＩＶ）引物的合成參考國家農業行業標準［１］、新城疫病毒（Ｎｅｗ ｃａｓｔｌｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）、減蛋綜合征病毒（Ｅｇｇ ｄｒｏｐ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ，ＥＤＳＶ）的特異性引物由本實驗室設計并合成保存。

２．３病毒ＲＮＡ的提取

將卵巢、肺、腦等病變組織剪碎，加生理鹽水研磨后凍融３次，１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ，取上清２５０ μＬ，根據ＲＮＡ提取試劑盒說明書提取病毒全基因組ＲＮＡ。病毒ＲＮＡ樣品用３０ μＬ的ＤＥＰＣ水溶解。

２．４一步法ＲＴ－ＰＣＲ及產物純化

取５ μＬ ＲＮＡ作為模板進行黃病毒的ＲＴ－ＰＣＲ擴增。ＲＴ－ＰＣＲ反應體系為：５ μＬ １０×ｂｕｆｆｅｒ（含Ｍｇ２＋），１ μＬ ｄＮＴＰｓ，１ μＬ上游引物，１ μＬ下游引物，１ μＬ 模板，０．５ μＬ Ｔａｑ酶，０．５ μＬ Ｍ－ＭＬＶ酶，１０．０ μＬ Ｈ２Ｏ；ＲＴ－ＰＣＲ反應條件為：４２ ℃ ３０ ｍｉｎ，９５ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ ｓ，５５ ℃ ３０ ｓ，７２ ℃ １．５ ｍｉｎ，３３個循環；７２ ℃ １０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物以２％瓊脂糖凝膠電泳。電泳完成后切下目的片段，用Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ純化回收ＤＮＡ。同時利用ＡＩＶ、ＮＤＶ、ＥＤＳＶ的特異性引物進行ＰＣＲ擴增。

２．５測序與序列分析

擴增出的目的基因片段回收，送往北京英駿公司測序。測序結果用ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）在線進行同源搜索。核酸和氨基酸分別用ＤＮＡｓｔａｒ軟件中的ＭｅｇＡｌｉｇｎ程序的Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ運算，結果用ＧｅｎｅＤｏｃ２．６（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｓｃ．ｅｄｕ／ｂｉｏｍｅｄ／ｇｅｎｅｄｏｃ／）進行遺傳進化分析，分析所用病毒及其ＧｅｎＢａｎｋ登錄號見表１。

３結果

３．１細菌分離結果

無菌條件下取病鴨的心血、腦等組織，３７ ℃恒溫培養２４～４８ ｈ后，未見透明、圓形的菌落，幾個大菌落經涂片染色鏡檢觀察，為常見大腸桿菌。

３．２ＰＣＲ檢測結果

組織樣品有１０份，用兩對不同的引物對樣品提取的ＲＮＡ進行擴增，從圖片可以清晰地看到樣品３和樣品４均出現了目的條帶，目的條帶較大的為第一對引物擴增，約４５０ ｂｐ（圖１左），目的條帶較小的為第二對引物擴增，約３３０ ｂｐ（圖１右）。將測出的陽性樣品３進行大量擴增，擴增出約４５０ ｂｐ的目的條帶（圖２），電泳完成后切下目的片段，用Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ純化回收ＤＮＡ。

同時用ＡＩＶ、ＮＤＶ、ＥＤＳＶ的特異性引物進行ＲＴ－ＰＣＲ擴增，其結果均為陰性，未見擴增出目的條帶。

３．３同源性分析和進化分析

將測序的結果經ＢＬＡＳＴ分析表明，擴增的序列屬于黃病毒的ＮＳ５基因。因此，檢測出的病料中應該含有一種黃病毒。從黃病毒屬的７個不同的病毒群中選取已知ＮＳ５序列的病毒進行序列同源性分析和進化分析。用ＤＮＡｓｔａｒ的ＣＬＵＳＴＡＬＷ分析顯示，該株病毒ＤＨＯＶ與ｓｔｒａｉｎ ｓｉｔｉａｗａｎ和ｓｔｒａｉｎ ＴＨＣＡｒ同源性最高，分別為８７．１％和８９．３％，用擴增的ＮＳ５序列構建的進化樹（圖３）所示，ＤＨＯＶ與ｓｔｒａｉｎ ｓｉｔｉａｗａｎ和ｓｔｒａｉｎ ＴＨＣＡｒ位于同一個小的分支，具有相近的遺傳進化關系。由此推斷該毒株應該同屬于黃病毒屬的恩塔亞病毒群。

４討論

黃病毒科黃病毒屬由超過７０種病毒組成［２］，分為蜱傳病毒、蚊媒病毒和節肢動物媒介未知的病毒。蚊媒病毒類又分為Ａｒｏａ病毒群（Aｒｏａ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）、登革熱病毒群（Dｅｎｇｕｅ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ，ＤＥＶ群）、ＪＥＶ群、科科貝拉病毒群（Kｏｋｏｂｅｒａ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）、恩塔亞病毒群（Ｎｔａｙａ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ，ＮＴＡＶ群）、斯寵德溫尼病毒群（Sｐｏｎｄｅｗｅｎｉ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ）和黃熱病病毒群（Yｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｇｒｏｕｐ，ＹＦＶ群）［３］。近年來，黃病毒分布越來越廣，可能與全球變暖有一定的關系［４，５］。

在我國，主要的黃病毒為流行性乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒和登革熱病毒［６］。自２０１０年以來，我國上海、浙江和江蘇等地均出現了鴨黃病毒感染的事件［７］。在湖北省一些養鴨場也出現不明原因的產蛋下降，臨床表現為產蛋嚴重下降甚至停止，并有一定的致死率，剖檢病鴨脾臟呈現明顯腫大，卵巢肉變，卵泡嚴重充血、出血。

在本試驗中用采集的組織樣品肺、腦、病變的輸卵管和出血的卵泡進行基因組的提取，從檢測結果初步分析，病變的卵泡檢測出鴨黃病毒陽性，而肺、腦及輸卵管均未檢測出陽性，這除了與本試驗建立的檢測方法的敏感性有關外，應與該病毒的含量也有關系，這為臨床樣品的采集和檢測提供了一定依據。而該株黃病毒的組織嗜性還有待在進一步的動物回歸試驗中進行系統研究。本研究檢測出的黃病毒，對擴增出的產物序列進行同源性分析和進化分析的結果表明，該株病毒與黃病毒科黃病毒屬蚊媒病毒類的恩塔亞病毒群的Tｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ＴＨＣＡｒ和Ｔｅｍｂｕｓｕ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｓｉｔｉａｗａｎ具有相近的遺傳進化關系，應該也屬于恩塔亞病毒群，但亦存在明顯的遺傳距離。因此，該病毒可能是黃病毒屬的一個新成員。目前本實驗室正在開展該病毒分離及其生物學特性方面的研究。

參考文獻：

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