乳樣保存條件對乳尿素氮濃度測定的影響

摘要：研究了３種常用的防腐劑（重鉻酸鉀、苯甲酸鈉和山梨酸鉀）以及室溫、冷藏和冷凍等３種不同溫度的保存條件對牛奶中乳尿素氮濃度測定的影響。結果表明，添加常規劑量和加倍劑量重鉻酸鉀乳樣的尿素氮濃度與原乳樣差異不顯著（Ｐ＞０．０５），而添加行業標準量及加倍劑量苯甲酸鈉、山梨酸鉀的乳樣中乳尿素氮濃度顯著高于原乳樣（Ｐ＜０．０５）；室溫和冷藏溫度條件下隨保存時間的延長，原乳樣乳尿素氮濃度迅速降低，而冷凍保存條件下原乳樣乳尿素氮濃度基本不變；添加重鉻酸鉀的乳樣在室溫、冷藏和冷凍條件下，隨著保存時間的延長乳尿素氮濃度均無明顯變化。乳樣收集后若不能及時測定乳尿素氮濃度，建議添加重鉻酸鉀防腐劑，未添加重鉻酸鉀時冷凍保存。

關鍵詞：乳尿素氮；乳樣；防腐劑；溫度條件

中圖分類號：Ｏ６５７．３２；TS252.26 文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3828-03

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｌｋ Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ

ＬＩＮ Ｗｅｎ－ｙａｎ，ＺＨＡＩ Ｓｈａｏ－ｗｅｉ，ＣＨＥＮＧ Ｓｈｉ－ｍｉｎｇ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ / Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｊｉｍｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉａｍｅｎ ３６１０２１， Ｆｕｊｉａｎ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔs ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｃｈｒｏｍａｔｅ， ｓｏｄｉｕｍ ｂｅｎｚｏａｔｅ， ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ） ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅs （ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｃｈｉｌｌｅｄ ａｎｄ ｆｒｏｚｅｎ） ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ of ｍｉｌｋ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ （ＭＵＮ） ｗere ｓｔｕｄｉｅｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＵＮ ｗｉｔｈ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｃｈｒｏｍａｔｅ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｏｓｅ ｏｒ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｄｏｓｅ had ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ（Ｐ＞０．０５）， ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＵＮ ｗｉｔｈ ｓｏｄｉｕｍ ｂｅｎｚｏａｔｅ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｓｏｒｂａｔｅ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｄｏｓｅ ｏｒ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｄｏｓｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ （Ｐ＜０．０５）， ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ at ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ or ｃｈｉｌｌｅｄ ｗｏｕｌｄ ｍａkｅ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＵＮ ｒｅｄｕｃｅ rapidly ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄ， ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ at ｆｒｏｚｅｎ ｗｏｕｌｄ ｍａｄｅ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＵＮ ｒｅｍａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｌｅｖｅｌ， ｔｈｅ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ ｗｉｔｈ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｃｈｉｌｌｅｄ ａｎｄ ｆｒｏｚｅｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＵＮ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅ． Ｏｎｃｅ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｂｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ， it was proposed that ｔｈｅ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｄｉｃｈｒｏｍａｔｅ ｔｏ be ａｄｄｅｄ ｏｒ ｆｒｏｚｅｎ ｍｅｔｈｏｄ to be used when the potassium dichromate wasn’t added．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｉｌｋ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ； ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ； ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ； ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

牛乳中，尿素是非蛋白氮的主要來源，約占全部牛乳中所含氮的５％，其余９５％為真蛋白質［１］。測定乳尿素氮（Ｍｉｌｋ Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＵＮ）在奶牛生產中具有重要的意義，可利用乳尿素氮來估測奶牛尿氮的排泄量［２］、奶牛的蛋白質營養狀況［３，４］、加快奶牛的遺傳進展［５］及提高奶牛的繁殖性能［６］。在實際測定ＭＵＮ的過程中，需要對乳樣進行一定條件的保存。乳樣進行保存方式有室溫、冷藏和冷凍，并且一般收集的乳樣通常會添加防腐劑，如添加０．０６％（ｍ／ｖ）的重鉻酸鉀等 ［７］。不同保存溫度條件以及防腐劑的添加對二乙酰一肟法測定結果有無影響，與此相關的研究還鮮見報道，本試驗旨在研究不同種類的常用防腐劑及不同保存溫度（室溫、冷藏、冷凍）對乳尿素氮濃度測定的影響，為乳尿素氮分析在我國奶牛生產實踐中的進一步推廣應用提供基礎數據。

１材料和方法

１．１材料

奶樣：于集美區長富牛奶供奶中心購買長富牌２５０ ｍＬ袋裝鮮牛奶。

１．２主要試劑

防腐劑：重鉻酸鉀、苯甲酸、山梨酸等均為分析純；尿素（ＢＵＮ）試劑盒（長春匯力生物技術有限公司生產；二乙酰一肟法測定）。

１．３主要儀器

ＵＶ－２８０２Ｈ型紫外可見分光光度計［尤尼柯（上海）儀器有限公司，中國］。

１．４不同防腐劑及添加劑量對MUN測定的影響

１．４．１樣品處理原乳樣：取奶樣５ ｍＬ，以５ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，去除上層乳脂，移取下層乳樣０．８ ｍＬ裝入離心管中，保存待用。添加防腐劑的乳樣：添加常規的乳樣，分別取奶樣５ ｍＬ，各加入０．００３ ｇ重鉻酸鉀（０．０６％，ｍ／Ｖ）、０．００５ ｇ苯甲酸鈉（０．１％，ｍ／Ｖ）、０．００５ ｇ山梨酸鉀（０．１％，ｍ／Ｖ）［７，８］，搖勻；同時添加２倍劑量防腐劑的乳樣，搖勻后，同原乳樣樣品前處理方法操作，并保存待用。

１．４．２測定ＭＵＮ濃度操作步驟按照試劑盒說明操作，將試劑盒中的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ按照體積比

２∶１的比例均勻混合，作為顯色劑。樣本和試劑的添加量見表１。

混勻，置于沸水浴中加熱，持續沸騰１０ ｍｉｎ后取出，用冷水沖淋５ ｍｉｎ，并在５１０ ｎｍ下測定標準管吸光度值（Ａ標）和樣品管吸光度值（Ａ樣），按公式計算測定結果。

計算公式：Ｃ樣＝×Ｃ標（其中，Ｃ標＝７．１４ ｍｍｏｌ／Ｌ）

１．５不同保存條件對MUN測定的影響

樣品處理：方法同１．４．１。原乳樣：各７支分別冷凍、冷藏、８支常溫保存。添加含０．０６％（ｍ／Ｖ）重鉻酸鉀防腐劑的乳樣：各７支分別冷凍、冷藏、８支常溫保存。

測定方法：同１．４．２

１．６統計分析

所有數據用ＥＸＣＥＬ軟件進行處理，并在ＳＰＳＳ１０．０ ＡＮＯＮＶＡ模塊上進行分析，顯著水平為Ｐ＜０．０５。

２結果與討論

２．１不同防腐劑及添加水平對MUN測定的影響

２．１．１添加重鉻酸鉀防腐劑的乳樣與原乳樣的ＭＵＮ濃度比較結果如圖１所示。由圖１可知，添加常規劑量重鉻酸鉀防腐劑的乳樣中，ＭＵＮ濃度略高于原乳樣，在統計上差異不顯著（Ｐ＞０．０５）；添加２倍劑量重鉻酸鉀防腐劑的乳樣中，ＭＵＮ濃度略高于原乳樣，同時也稍高于添加常規劑量重鉻酸鉀乳樣的ＭＵＮ濃度，但與二者在統計上差異仍不顯著（Ｐ＞０．０５）。所以推薦使用常規劑量的重鉻酸鉀防腐劑來保存乳樣。

２．１．２添加苯甲酸鈉防腐劑的乳樣與原乳樣的ＭＵＮ濃度比較結果如圖２所示。由圖２可知，添加常規劑量苯甲酸鈉防腐劑的乳樣中，ＭＵＮ濃度略高于原乳樣，在統計上差異顯著（Ｐ＜０．０５）；添加２倍劑量苯甲酸鈉防腐劑的乳樣中，ＭＵＮ濃度顯著高于原乳樣（Ｐ＜０．０５），也高于添加常規劑量苯甲酸鈉防腐劑的乳樣（Ｐ＞０．０５）。所以不推薦使用苯甲酸鈉來保存乳樣。

２．１．３添加山梨酸鉀防腐劑的乳樣與原乳樣的ＭＵＮ濃度比較結果如圖３所示。由圖３可知，添加常規劑量山梨酸鉀防腐劑的乳樣中，其ＭＵＮ濃度略高于原乳樣，在統計上差異顯著（Ｐ＜０．０５）；添加２倍劑量山梨酸鉀防腐劑的乳樣中，其ＭＵＮ濃度顯著高于原乳樣（Ｐ＜０．０５），也高于添加常規劑量山梨酸鉀防腐劑的乳樣（Ｐ＞０．０５）。所以不推薦使用山梨酸鉀防腐劑來保存乳樣。

２．２不同保存條件對MUN測定的影響

２．２．１原乳樣在不同的保存條件下ＭＵＮ濃度的變化情況結果如圖４所示。由圖４可知，對于未添加防腐劑的原乳樣，在常溫的保存條件下，原乳樣的ＭＵＮ濃度逐漸下降，尤其在前６ ｄ的下降幅度很大，6 d之后的變化幅度逐漸減小，并維持較低水平；在冷藏的保存條件下，4~１０ d變化幅度較大，１２ d之后的變化不大，也是在較低的水平；在冷凍的保存條件下，原乳樣的ＭＵＮ濃度變化不大，保持在初始水平。

２．２．２添加重鉻酸鉀防腐劑的乳樣在不同的保存條件下ＭＵＮ濃度的變化情況結果如圖５所示。由圖５可知，對于添加常規劑量重鉻酸鉀防腐劑的乳樣，在常溫、冷藏和冷凍保存條件下，乳樣的ＭＵＮ濃度變化都不大，差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。

Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ等［９］報道，未加防腐劑的乳樣在室溫條件下，ＭＵＮ濃度逐漸降低，2 ｄ后降低了５０％。Ｈａａｇ［１０］的研究發現，室溫下保存乳樣８ ｄ后，ＭＵＮ濃度降低了５８％。雖然不同研究室溫下ＭＵＮ濃度下降的幅度有些差異，但都表明室溫下的乳樣測定應該及時進行，以避免ＭＵＮ濃度下降造成測定誤差加大。

而郭同軍等［１１］在對牛奶保存方法和采樣時間對乳尿素氮變化的影響研究中發現，與鮮樣相比，添加防腐劑保存的乳樣和通過冷凍方法保存的乳樣ＭＵＮ濃度都上升，其排序為：添加防腐劑的ＭＵＮ濃度＞冷凍方法保存乳樣的ＭＵＮ濃度＞鮮樣的ＭＵＮ濃度。加防腐劑保存乳樣的ＭＵＮ濃度與鮮樣的ＭＵＮ濃度差異極顯著（Ｐ＜０．０１），與冷凍保存樣ＭＵＮ濃度差異不顯著；冷凍保存樣的ＭＵＮ濃度與鮮樣ＭＵＮ濃度差異極顯著（Ｐ＜０．０１）。這與本研究的結果差異較大，可能是測定方法差異所致。

在鮮乳中占活動優勢的微生物主要是一些細菌、酵母菌和少數霉菌［１２］。大多數的細菌、放線菌、真菌都能產生脲酶，能分解尿素為氨［１３］。牛奶中添加了防腐劑（重鉻酸鉀）或冷凍保存可能是抑制了產生脲酶的一些微生物（主要是細菌和霉菌）的生長繁殖，從而可以長時間保持牛奶ＭＵＮ的濃度不變。室溫下未加防腐劑的乳樣ＭＵＮ濃度2 d后急劇下降，很可能是此時產生脲酶的細菌和真菌大量繁殖所致。

由此可見，冷凍條件保存和添加適宜的防腐劑的乳樣在測定ＭＵＮ濃度時不會造成影響，可在２周內維持不變，未添加防腐劑的乳樣在室溫條件下應及時測定。

３小結

在乳樣的保存過程中，不論是常規劑量還是２倍劑量的重鉻酸鉀都能保持乳樣的ＭＵＮ濃度。乳樣中添加苯甲酸鈉、山梨酸鉀的測定結果卻顯著高于原乳樣。對于室溫、冷藏、冷凍這３種常用的保存乳樣的方式，室溫和冷藏都會使ＭＵＮ濃度隨時間推移降低幅度增大，冷凍能夠保持乳樣ＭＵＮ濃度保持不變。

參考文獻：

［１］ 楊鳳．動物營養學（第二版）［Ｍ］．北京：中國農業出版社，２００６．

［２］ ＺＨＡＩ Ｓ，ＬＩＵ Ｊ，ＷＵ Ｙ， et al． Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｕｒｉｎａｒｙ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｍｉｌｋ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｉｎ ｌａｃｔａｔｉｎｇ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈｏｌｓｔｅｉｎ ｃｏｗｓ ［Ｊ］． Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，７８（４）：３９５－３９９．

［３］ ＷＡＴＴＩＡＵＸ Ｍ Ａ， ＫＡＲＧ Ｋ Ｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ｆｏｒ ａｌｆａｌｆａ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｓｉｌａｇｅ－Ｂａｓｅｄ ｄｉｅｔｓ： Ｉ． ｌａｃｔａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ Ｍｉｌｋ Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ ［Ｊ］． Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ，２００４，８１：３４８０-３４９１．

［４］ ＪＯＮＫＥＲ Ｊ Ｓ， ＫＯＨＮ Ｒ Ａ， ＨＩＧＨ Ｊ． Ｕｓｅ ｏｆ ｍｉｌｋ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｄｉａｒｙ ｃｏｗｓ ｄｉｅｔｓ ［Ｊ］． Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．，２００２，８５：９３９-９４６．

［５］ ＷＯＯＤ Ｇ Ｍ， ＢＯＥＴＴＣＨＥＲ Ｐ Ｊ， ＪＡＭＲＯＺＩＫ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｉｌｋ ｕｒｅａ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ［Ｊ］． Ｊ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ，２００３，８６：２４６２-２４６９．

［６］ ＨＯＪＭＡＮ Ｄ， ＫＲＯＬＬ Ｏ， ＡＤＩＮ Ｇ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｉｌｋ ｕｒｅａ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ， ａｎｄ ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ ｔｒａｉｔｓ ｉｎ Ｉｓｒａｅｌｉ ｄａｉｒｙ ｈｅｒｄｓ［Ｊ］． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ， ２００４，８７：１００１-１０１１．

［７］ 吳志廣，李建國，李秋鳳，等． 日糧氮氨酸鋅水平對奶牛生產性能和血液指標的影響［Ｊ］． 中國獸醫學報，２００８，２８（２）：２０４－２０７．

［８］ＧＢ ２７６０－２００７ 食品添加劑使用衛生標準［Ｓ］．

［９］ ＭＩＥＴＴＩＮＥＮ Ｐ Ｖ， ＪＵＶＯＮＥＮ Ｒ Ｏ． Ｄｉｕｒｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｕｒｅａ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｃｏｗｓ［Ｊ］． Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃ Ｓａｃｎｄ，１９９０，４０：２８９－２９６．

［１０］ ＨＡＡＧ Ｔ． Ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｕｒｅａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｃｏｗ ｍｉｌｋ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｉｎ ｃａｓｅ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ［Ｄ］． Ｊｕｓｔｕｓ Ｌｉｅｂｉｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｉｅｓｓｅｎ， １９８８．

［１１］ 郭同軍，王加啟，卜登攀，等． 牛奶保存方法和采樣時間對乳尿素氮變化的影響［Ｊ］． 中國奶牛，２００８，６（１）：２２－２３．

［１２］ 楊潔彬，李淑高，張簇，等．食品微生物學［Ｍ］． 第二版.北京：北京農業大學出版社，１９９５．

［１３］ 閔航，趙宇華． 微生物學［Ｍ］．杭州：浙江大學出版社，１９９８．