S15菌株的抗菌活性及抗菌物質的特性

摘要：為開發新的用于生物防治的抗真菌微生物資源，對從荊州郊區土壤中分離到的一株對多種植物病原真菌具有顯著拮抗作用的鏈霉菌Ｓ１５，用瓊脂塊法和杯碟法對其抗菌譜進行測定。結果表明，產生的拮抗物質對１３種植物病原菌有顯著抑制效果，其產生的代謝產物具有對小麥全蝕病病菌菌絲扭曲、縊縮等致畸效應。該物質對熱穩定性較好，在酸性條件下易失活，在中性偏堿條件下比較穩定，此抗真菌物質有較強的極性。

關鍵詞：鏈霉菌Ｓ１５；抗真菌活性；抗菌物質特性

中圖分類號：S482.2+8文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3722-03

Antifungal Activities and Characterization of Antifungal Substance of Streptomycete S15

ＷＵ Ｈｕａ－ｗｅｉ，ＸＩＡ Ｆａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ， ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ Ｓ１５ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ａｎｔａｇｏｎｉｚｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｅｖｅｒａｌ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆａｒｍｌａｎｄ ｓｏｉｌｓ in Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ｄｉｓｔｒｉｃｔ． Ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｃｕｐ－ｄｉｓｈ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ａｇａｒ ｃｏｌｕｍｎ ｍｅｔｈｏｄ， ｔｈｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｓ１５ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ that ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｓ１５ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ １５ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ． Ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｃｏｕｌｄ ｃａｕｓｅ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｏｆ ｇａｅｕｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ｔｈｅｒｍｏ－ｓｔａｂｉｌｉｔｙ. Ｉｔ ｗａｓ ｕｎｓｔａｂｌｅ ｉｎ ａｃｉｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｂｕｔ ｓｈｏｗｅｄ ｈｉｇｈ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｎｅｕｔｒａｌ ｏｒ ａｌｋａｌｉｎｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｐｏｌａｒｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅ Ｓ１５； ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ of antagonistic substance

隨著可持續農業觀的建立，探索無公害、無污染的生物防治措施已成為植物病害綜合治理中的重要課題，日益受到世界各國的重視［１，２］。植物真菌病害的有效防治迫切需要新的高效、低毒、廣譜的抗真菌藥物，使尋找新的抗真菌藥物成為當前抗生素研究中的一個熱點，生物防治的關鍵在于篩選理想的拮抗菌株［３］。基于此，以分離自荊州市郊區農田、果園、菜園土壤中的鏈霉菌菌株為對象，研究了Ｓ１５菌株發酵液對１３種植物病原真菌的抑制活性及抗菌物質的相關理化性質。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌株鏈霉菌Ｓ１５從荊州市郊區農田土壤中分離并保存。植物病原菌（棉花枯萎病病菌、棉花疫霉病病菌、棉花黃矮病病菌、小麥全蝕病病菌、小麥赤霉病病菌、小麥根霉病病菌、蘋果腐爛病病菌、蘋果炭疽病病菌、水稻稻瘟病病菌、西瓜炭疽病病菌、西瓜軟腐病病菌、水稻白葉枯病病菌、玉米圓斑病病菌、辣椒根腐病病菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉）由江蘇省農業科學院植物保護中心提供。

１．１．２培養基真菌用土豆固體或半固體培養基，鏈霉菌Ｓ１５用高氏一號固體或液體培養基，細菌用牛肉膏蛋白胨固體培養基，酵母菌用麥芽汁培養基。

１．１．３培養條件鏈霉菌Ｓ１５搖瓶發酵產抗菌物質的條件：Ｓ１５的孢子接種到高氏一號斜面培養基上，２８ ℃培養６ ｄ，長成豐富的孢子。然后將孢子接種到種子培養基中，１００ ｍＬ三角瓶裝３０ ｍＬ培養基，２８ ℃、１２０ ｒ／ｍｉｎ培養２ ｄ，然后以５％接種量接種到新鮮的高氏一號培養基中，在１２０ ｒ/ｍｉｎ、２８ ℃條件下振蕩培養６ ｄ，經８層紗布過濾掉菌體后，以

１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ 離心１５０ ｍｉｎ，取上清液備用。

１．２方法

１．２．１抑菌活性的測定

１）發酵液抗菌活性測定（杯碟法［４，５］）。將鏈霉菌Ｓ１５和所有指示菌活化，挑取若干活化的Ｓ１５，接到無菌水中，用玻璃珠打散，制備成菌懸液，取菌懸液１００ μＬ，倒入含２５ ｍＬ高氏一號固體培養基的冷卻平板中，涂布均勻后于２８ ℃恒溫培養３ ｄ。在上述長好菌的平板上放置牛津杯，吸取處理好的發酵液上清液２００ μＬ于牛津杯中，２８ ℃培養３６ ｈ后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑（牛津杯直徑約７．６３ ｍｍ）記下抑菌圈直徑。

２）平板瓊脂塊法［６，７］測定抑菌活性。用打孔器在鏈霉菌Ｓ１５菌平板上打出直徑７ ｍｍ的瓊脂柱，用接種鉤將瓊脂柱移至高氏一號固體培養基底層平板中央，２８ ℃恒溫正置培養２ ｄ，然后倒入接種有植物病原菌的冷卻到５０ ℃左右的土豆汁半固體培養基上，使高氏一號培養基表面附有薄薄的一層指示菌液，在２８ ℃恒溫培養箱正置培養３６ ｈ，細菌在３７ ℃下培養。記錄抑菌性質并測量抑菌圈直徑，每個處理３次重復，取平均值。

１．２．２Ｓ１５對小麥全蝕病病菌菌絲形態影響的觀察以小麥全蝕病病菌做指示菌，采用杯碟法測定抑菌活性，待出現抑菌圈后，挑取抑菌圈邊緣指示菌菌絲和正常培養的指示菌菌絲，經棉藍染液染色，于光學顯微鏡１００倍油鏡觀察。

１．２．３發酵液中抗菌物質的特性研究

１）溫度對抗真菌物質抑菌特性的影響。取發酵液的上清液，分別在４０、６０、８０、１００和１２１ ℃下處理２０ ｍｉｎ，用未經處理（室溫２５ ℃）的無菌濾液作對照，以小麥全蝕病病菌為指示菌，用杯碟法測定抑菌圈直徑，根據抑菌圈直徑大小來確定其熱穩定性。

２）ｐＨ值對抗真菌物質抑菌特性的影響。取１０只刻度試管，每只試管添加３ ｍＬ發酵上清液，在室溫（３０ ℃）用ＮａＯＨ和ＨＣｌ分別調ｐＨ值到３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０和１０．０，處理４ ｈ后再依次調ｐＨ值至７．０，用去離子無菌水定容至６ ｍＬ，進行抗真菌效果試驗，以小麥全蝕病病菌為指示菌做抑菌試驗，對照為未處理的發酵上清液，測定抑菌圈直徑，確定抗菌物質的酸堿穩定性。

３）有機溶劑對抗真菌物質抑菌特性的影響。 分別將發酵上清液與乙酸乙酯、乙醚、正己烷、正丁醇按１∶１（Ｖ／Ｖ）的體積比混合，振蕩萃取１ ｈ再注入分液漏斗靜置０．５ ｈ后分液，分別檢測發酵上清液用乙酸乙酯、乙醚、正己烷、正丁醇萃取后的水相和有機相對小麥全蝕病病菌的抑菌活性，以未處理的發酵上清液和各有機溶劑為對照。

２結果與分析

２．１鏈霉菌Ｓ１５抗真菌活性測定

應用杯碟法和瓊脂塊法，測定了Ｓ１５菌株對１６種植物病原真菌和２種病原細菌的抑制作用。結果（表１）表明，除對水稻白葉枯病病菌、辣椒根腐病病菌的抑菌圈比較小，對細菌和酵母基本沒有抑制作用外，對其他１３種植物病原真菌抑菌效果都比較明顯，其中對小麥全蝕病病菌和蘋果腐爛病病菌的抑制效果最顯著（圖１），說明Ｓ１５菌株對植物病原真菌具有廣譜抑制作用。

２．２Ｓ１５菌株對小麥全蝕病病菌菌絲形態的影響

光學顯微鏡下觀察Ｓ１５菌株對小麥全蝕病病菌抑制圈周圍菌絲的生長形態，結果（圖２）顯示，抑菌物質存在下的病原菌菌絲出現扭曲，頂端膨大，出現泡狀物、縊縮等現象，而正常生長的菌絲細長、均勻。

２．３抑菌物質的溫度穩定性

由表２可知，S15菌株產生的抗菌物質具有較好的熱穩定性，與對照相比，在４０、６０ ℃以下溫度處理，對其抗菌活性沒有影響，但隨著溫度的升高，抑制圈直徑會逐漸變小。經１００ ℃處理２０ ｍｉｎ后，抑菌活性仍然保留有原來的８１％，該物質的耐高溫屬性使得其提取純化相對容易。

２．４抑菌物質的ｐＨ值穩定性

在不同ｐＨ值下，發酵液的抑菌試驗結果如表３。表３結果表明，抗真菌物質在ｐＨ值６．０～９．０范圍內保持較高的抑菌活性，抑菌活性最高的為ｐＨ值８．０，在堿性范圍內，抑菌物質的活性較為穩定，在ｐＨ值３．０～５．０范圍內，隨ｐＨ值的降低，抑菌活性迅速下降，說明該物質在酸性條件下極不穩定，而在堿性條件下比較穩定，故在以后的分離和純化過程中，宜在ｐＨ值６．０～８．０下進行。

２．５有機溶劑對抗真菌物質抑菌特性的影響

乙酸乙酯、乙醚、正己烷、正丁醇4種有機溶劑萃取發酵液后，有機相和水相分別做抑菌試驗，結果（表4）表明，發酵上清液中的抗菌物質易溶于乙酸乙酯、正丁醇等極性有機溶劑，不溶于正己烷、乙醚等非極性有機溶劑，所以大致判斷該物質極性較強。因此，Ｓ１５產生的抗菌物質宜用乙酸乙酯萃取。

３小結

以從土壤中篩選的抗生菌中得到一株廣譜、高活性抗真菌的鏈霉菌Ｓ１５為對象，通過瓊脂塊法和杯碟法測定了該菌株對１６種植物病原菌的抑菌活性。試驗結果表明，Ｓ１５菌株發酵液對小麥全蝕病病菌的抑制效果最好，對小麥根霉病病菌、蘋果腐爛病病菌和棉花黃矮病病菌的抑制效果也較好。Ｓ１５菌株及其分泌的抑菌物質能使小麥全蝕病病菌菌絲生長受到抑制，使病原菌菌絲發生嚴重的畸變、膨大甚至溶解，表現出一定的殺菌作用，其具體的抑菌機理還有待于進一步研究。

Ｓ１５菌株分泌的抑菌物質對熱和堿的穩定性較好，但對酸的穩定性較差，當ｐＨ值小于４．０，抗菌活性急劇下降；抗菌物質屬于極性較強的物質，在萃取時選用乙酸乙酯效果較好，這些性質的探明都為下一步對該物質進行分離純化及結構測定提供了理論依據，并為該物質最終開發成生物農藥打下了基礎。

參考文獻：

［１］ 暴增海，楊文蘭，吳學仁，等． 粘帚霉（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐｐ．）不同菌株對幾種病原菌的抑菌作用測定［Ｊ］．吉林農業大學學報，２００４，２６（４）：３９４－３９８．

［２］ 余鳳玉，李振化，曾會才．抗真菌農用抗生素的研究進展［Ｊ］．熱帶農業科學，２００５，２５（１）：６０－６５．

［３］ 顧覺奮，倪孟祥，李治川． 微生物來源的抗真菌抗生素的研究進展［Ｊ］．中國新藥雜志，２００１，１０（５）：３２８－３３０．

［４］ 徐方旭，劉詩揚，賀海升，等． 食用菌栽培中有效抗霉藥物的篩選［Ｊ］．河南農業科學，２０１０（４）：６６－６９．

［５］ 雷波． 管碟法測定抗生素效價方法的優化研究［Ｊ］．重慶師范大學學報（自然科學版）２００６，２３（３）：８５－８７．

［６］ 王德金，田威，傅瑤，等． 瓊脂塊篩選法在多殺菌素菌種選育中的應用［Ｊ］． 沈陽藥科大學學報，２０１０，２７（４）：３２０－３２３．

［７］ 林敏，寧喜斌． 具抑菌活性海洋微生物的篩選［Ｊ］． 微生物學雜志，２００５，２５（５）：２３－２５．