ＮaCl脅迫下堿蓬基因組MSAP分析

摘要：采用甲基化敏感擴增多態(tài)性（ＭＳＡＰ）技術檢測ＮａＣｌ脅迫下堿蓬（Ｓｕａｅｄａ ｓａｌｓａ Ｌ．）基因組ＤＮＡ甲基化的變化，結(jié)果顯示，堿蓬基因組ＤＮＡ全甲基化比率與ＮａＣｌ處理濃度存在一定的劑量效應關系（Ｒ＝－０．９２）；利用１８種組合的引物，檢測不同ＮａＣｌ濃度處理下堿蓬基因組時共發(fā)現(xiàn)147個甲基化位點。

關鍵詞：堿蓬；ＤＮＡ甲基化；高鹽ＣＴＡＢ；ＭＳＡＰ

中圖分類號：Ｑ９４９．７４５．１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3856-03

Methylation-sensitive Amplified Polymorphism of Suaeda salsa L. Genome under NaCl Stress

ＺＨＡＯ Ｘｉｕ－ｊｕａｎ，ＨＡＮ Ｙａ－ｎａｎ，ＣＡＩ Ｌｕ

（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｕａｅｄａ ｓａｌｓａ Ｌ． ｇｅｎｏｍｅ ｕｎｄｅｒ ＮａＣｌ ｓｔｒｅｓｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＭＳＡＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ （Ｒ＝－０．９２） ｂｅｔｗｅｅｎ ＮａＣｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｕａｅｄａ ｓａｌｓａ； １４７ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ abtained from treatments ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎs of ＮａＣｌ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｕｓｉｎｇ １８ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｉｍｅｒｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｕａｅｄａ ｓａｌｓａ Ｌ．； ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ； ｈｉｇｈ ｓａｌｔ ＣＴＡＢ； ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＭＳＡＰ）

甲基化敏感擴增多態(tài)性（ＭＳＡＰ）技術是一種基于同裂酶應用在ＡＦＬＰ基礎上發(fā)展起來的檢測基因組ＤＮＡ甲基化的方法［１］。由ＭｓｐⅠ代替ＭｓｅⅠ作為內(nèi)切酶，與ＨｐａⅡ配對，共同識別５’－ＣＣＧＧ－３’序列，由于二者對ＤＮＡ甲基化有不同的敏感性而顯示不同的多態(tài)性。目前，此技術已經(jīng)應用于小麥［２］、水稻［３］及玉米［４］等糧食作物的ＤＮＡ甲基化檢測，擬南芥［５］、棉花［６］及油菜［７］等植物的研究中也應用到了此項技術。

堿蓬（Ｓｕａｅｄａ ｓａｌｓａ Ｌ．）分布于我國東北、西北、華北及沿海各省，主要生于鹽堿地、河岸、湖邊［８］。其富含氨基酸和胡蘿卜素等，可作為蔬菜食用，種子可用于榨油。一般在含鹽量高達３％的潮間帶也能稀疏叢生，是一種典型的鹽堿地指示植物。該實驗利用ＤＮＡ甲基化檢測技術——ＭＳＡＰ技術，檢測鹽生植物鹽脅迫下ＤＮＡ甲基化的變化機制，建立鹽濃度與ＤＮＡ甲基化之間的劑量效應關系，為研究耐鹽機理做好理論基礎。

１材料和方法

１．１材料

挑選飽滿的堿蓬種子，土壤種植。待其長出幼苗后，分別用濃度為０、１５０、３００、４５０、６００ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ澆灌，每隔一天澆一次，每次１５ ｍＬ，處理７ ｄ后提取基因組ＤＮＡ。

１．２方法

１．２．１堿蓬基因組ＤＮＡ的提取與檢測采用高鹽ＣＴＡＢ法［９］提取堿蓬基因組ＤＮＡ，利用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測ＤＮＡ提取濃度和質(zhì)量。

１．２．２ＭＳＡＰ技術

１）限制性酶切和連接。限制性酶切和連接前，將兩個單鏈的接頭復性為雙鏈結(jié)構，即１００ ℃變性５ ｍｉｎ，緩慢冷卻至室溫，－２０℃冷凍保存?zhèn)溆?。ＭＳＡＰ技術限制性酶切和連接體系如下：Ｔ４ １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ２．００ μＬ，１０ ｍｇ／Ｌ ＢＳＡ ０．１０ μＬ，５０ ｐｍｏｌ／Ｌ Ｅｃｏ ＲⅠＡｄａｐｔｏｒ ０．５０ μＬ，５０ ｐｍｏｌ／Ｌ Ｈ／Ｍ Ａｄａｐｔｏｒ ０．５０ μＬ，２０Ｕ／μＬ Ｅｃｏ ＲⅠ０．５０ μＬ，１０Ｕ／μＬ Ｈｐａ Ⅱ０．３０ μＬ加１０Ｕ／μＬ ＭｓｐⅠ０．１５ μＬ，Ｔ４ Ｌｉｇａｓｅ ０．１０ μＬ，ＤＮＡ ３００ｎｇ，用滅過菌的ｄｄＨ２Ｏ補足到總體積為２０．００ μＬ?；靹蚍磻w系，在３７ ℃條件下保溫酶切６ ｈ，繼續(xù)在８ ℃條件下保溫４ ｈ后４ ℃保存。

２）預擴增。反應體系如下：１０×ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５０ μＬ，２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ １．００ μＬ，５ μｍｏｌ／Ｌ Ｅｃｏ ＲⅠＡｄａｐｔｏｒ（Ｅ－Ａ） １．００ μＬ，５ μｍｏｌ／Ｌ Ｈ／Ｍ Ａｄａｐｔｏｒ（Ｈ／Ｍ－Ｏ） １．００ μＬ，５Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２０ μＬ，ＤＮＡ模板（酶切連接產(chǎn)物） ２．００ μＬ，用滅菌的ｄｄＨ２Ｏ補足到２５．００ μＬ?；靹蚍磻w系，按下列參數(shù)進行ＰＣＲ擴增反應：９４ ℃預變性２ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，５６ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸６０ ｓ，共進行３０個循環(huán)；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。用１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測，２００～１ ０００ ｂｐ ＤＮＡ呈彌散狀分布為最佳酶切連接結(jié)果。根據(jù)ＤＮＡ彌散帶的亮度，用１×ＴＥ緩沖液稀釋預擴增產(chǎn)物２倍至１０倍，作為選擇性ＰＣＲ擴增的ＤＮＡ模板。

３）選擇性擴增。反應體系如下：１０×ＰＣＲ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５０ μＬ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ０．６０ μＬ，５ μｍｏｌ／Ｌ Ｅｃｏ ＲⅠ Ｐｒｉｍｅｒ ０．６０ μＬ，５ μｍｏｌ／Ｌ Ｈ／Ｍ Ｐｒｉｍｅｒ ０．６０ μＬ，５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒｓｅ ０．１２ μＬ，ＤＮＡ 模板（預擴增稀釋產(chǎn)物）２．００ μＬ，用滅過菌的ｄｄＨ２Ｏ補足到總體積為１５．００ μＬ。混勻體系，按下列參數(shù)進行ＰＣＲ擴增反應：９４ ℃預變性２ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，６５ ℃退火３０ｓ，７２℃延伸８０ ｓ，以后每輪循環(huán)溫度遞減０．７ ℃或１．０ ℃，擴增１２或１０輪；接著９４ ℃變性３０ ｓ，５５ ℃退火３０ ｓ，７２ ℃延伸８０ ｓ，擴增２５輪；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，統(tǒng)計條帶數(shù)。

２結(jié)果與分析

２．１堿蓬基因組ＤＮＡ質(zhì)量檢測

利用１．５％瓊脂糖凝膠電泳檢測ＤＮＡ質(zhì)量，如圖1所示。利用紫外分光光度計檢測提取的堿蓬葉片基因組ＤＮＡ純度和濃度，ＯＤ２６０nm／２８０nm平均值為１．８左右，濃度平均值為２２０ ｎｇ／μＬ。

２．２堿蓬基因組ＤＮＡ的ＭＳＡＰ分析

在用５種鹽濃度處理的條件下，利用１８種組合的引物，共檢測到了１４７個甲基化位點。經(jīng)相關性分析，ＤＮＡ全甲基化比率和NaCl處理濃度之間存在一定的劑量效應關系（Ｒ＝－０．９２），列舉其中兩對引物的選擴聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，見圖2。

將１８對引物擴增得到的條帶數(shù)做統(tǒng)計分析得表２和圖３，結(jié)果顯示，ＤＮＡ甲基化變化曲線呈正弦分布；全甲基化比率，隨脅迫NaCl濃度升高整體呈下降趨勢；當脅迫NaCl濃度為１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，半甲基化比率達到峰值，之后曲線趨于平穩(wěn)。以上結(jié)論可推測，堿蓬基因組以全甲基化比率降低方式來適應逆境的加強。

３討論

實驗采用堿蓬作為研究材料，因為它是典型的鹽生植物，能夠適應高鹽土壤。有研究表明［１０］脅迫引起的低甲基化與基因表達有關，推論鹽環(huán)境脅迫促使堿蓬的某些抗鹽基因表達以適應逆境的正常生長，而這種相關基因的表達，促使植物出現(xiàn)一定程度的低甲基化現(xiàn)象，此結(jié)論正確與否有待于通過分離相關特異性片段做ＤＮＡ甲基化的特異性檢測以確定。

與此同時，實驗還采取了蒙古黃芪作為研究材料，結(jié)果顯示，蒙古黃芪隨鹽濃度脅迫升高，ＭＳＡＰ的下降趨勢更加明顯，劑量效應關系更加良好（Ｒ＝－０．９４３），由此假設，由于鹽生植物堿蓬的耐鹽性能更加良好，一些相關性抗鹽基因的表達更易被啟動，以致蒙古黃芪較堿蓬隨脅迫鹽濃度的升高出現(xiàn)低甲基化程度更加明顯。這樣就進一步論證了鹽環(huán)境引起的低甲基化與基因表達之間的關系。低甲基化是一種簡單且間接影響逆境脅迫的方式，也是一種準確調(diào)控基因表達的防御機制［１０］，因此，特異性序列的甲基化變化通常是與基因表達有關。根據(jù)實驗可以確定相關抗鹽基因，進一步確定抗鹽基因的甲基化水平與脅迫鹽濃度之間的影響機制，明確二者與基因表達的調(diào)控關系。

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