四唑染色法測定白花前胡種子生活力方法研究

摘要：為探討白花前胡（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ ｐｒａｅｒｕｐｔｏｒｕｍ Ｄｕｎｎ．）種子生活力的適宜測定方法，采用四唑（２，３， ５－氯化三苯基四氮唑；２，３，５-Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＴＴＣ）染色法，設(shè)置不同浸種時間、不同染色濃度、不同染色時間的正交試驗設(shè)計，來研究白花前胡種子的生活力測定條件。結(jié)果ＴＴＣ法測定白花前胡種子生活力的最佳條件為在３０ ℃環(huán)境下，浸種１０ ｈ，采用濃度１ ｇ／Ｌ的ＴＴＣ溶液在３5 ℃環(huán)境里染色１６ ｈ。此法可作為白花前胡種子生活力測定的標(biāo)準(zhǔn)方法。

關(guān)鍵詞：白花前胡；四唑染色法；種子生活力

中圖分類號：Ｓ５６７．７＋９；Ｑ９４５．３4文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3775-03

Study on TTC Method for Testing Seed Viability of Peucedanum praeruptorum

ＨＥ Ｌｉｎｇ－ｌｉ，ＹＩ Ｘｉｕ，ＹＡＮＧ Ｍｉｎ，ＣＨＥＮ Ｋｅ－ｌｉ

（School of Medicine / Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ｏｎ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，

Ｈｕｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｗｕｈａｎ ４３００６５， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ａ ｐｒｏｐｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｅｅｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ ｐｒａｅｒｕｐｔｏｒｕｍ Ｄｕｎｎ．， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏａｋｉｎｇ ｔｉｍｅ， ２，３，５－ｔｒｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ｔｔｃ） ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ＴＴＣ ｔｅｓｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｅｅｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐ． ｐｒａｅｒｕｐｔｏｒｕｍ ｗｅｒｅ ｓｏａｋｉｎｇ ｓｅｅｄｓ ａｔ ３０ ℃ ｆｏｒ １０ ｈ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ １ ｇ／Ｌ ＴＴＣ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｔ ３５ ℃ ｆｏｒ １６ ｈ． ＴＴＣ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｎｇ ｓｅｅｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐ． ｐｒａｅｒｕｐｔｏｒｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ ｐｒａｅｒｕｐｔｏｒｕｍ Ｄｕｎｎ．； ２， ３， ５－Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｔｅｓｔ； ｓｅｅｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ

種子的生活力是種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，是種用價值的主要組成部分，它與種子田間出苗率密切相關(guān)，是反映種子生命過程中十分重要的特性之一［１］。種子生活力測定也是快速鑒定種子發(fā)芽能力的一種間接方法，準(zhǔn)確的生活力測定方法能夠真實反映種子的發(fā)芽能力，尤其對一些休眠期長的種子更為適用。由于采用常規(guī)的發(fā)芽試驗來測定發(fā)芽力，需要的時間較長；而種子壽命長短各異，為了確定種子是否能用于播種及確定播種量，有必要進(jìn)行種子生活力的高效率測定。因此，研究不同種子生活力適宜的測定方法就具有重要意義［２］，而且種子生活力的測定是國內(nèi)外農(nóng)作物生產(chǎn)上非常重視和關(guān)注的內(nèi)容之一［３］。前胡為常用的中藥材，是傘形科（Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ）前胡屬（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ Ｌ．）植物白花前胡（Ｐｅｕｃｅｄａｎｕｍ ｐｒａｅｒｕｐｔｏｒｕｍ Ｄｕｎｎ．）的干燥根。具有疏散風(fēng)熱、降氣化痰的作用，臨床上用于治療風(fēng)熱咳嗽、痰多，痰熱喘滿，咯痰黃稠等癥。前胡最早收載于南北朝梁朝·陶弘景的《名醫(yī)別錄》中，被列為中品；以后歷代本草均有記載。白花前胡由于野生資源不足，已經(jīng)開始了較大規(guī)模的栽培；但迄今為止，有關(guān)白花前胡種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未制定，其生活力測定方法的研究報道甚少。四唑（２，３，５-氯化三苯基四氮唑；２，３，５-Ｔｒｉｐｈｅｎｙｌ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ，ＴＴＣ）染色法為目前國際上公認(rèn)的測定種子生活力較好方法，其原理為有生活力的種子胚細(xì)胞含有脫氫酶，具有脫氫還原作用，被種子所吸收的無色ＴＴＣ接受了活種子呼吸過程中脫氫酶產(chǎn)生的氫，而變成還原態(tài)的紅色穩(wěn)定不擴(kuò)散物質(zhì)［４］，即不溶于水的三苯基甲替，而無生活力的種子則無此反應(yīng)，故無染色出現(xiàn)，由此可按胚組織的染色情況區(qū)分有生活力的種子和無生活力的種子。試驗以白花前胡種子為材料，探討采用ＴＴＣ法快速測定白花前胡種子生活力的適宜方法，以期為白花前胡種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)依據(jù)。

１材料與方法

１．１種子來源

白花前胡種子于２００９年１１月分別采自湖北省長陽縣（其中又分為低海拔點、海拔８００ ｍ點、海拔１ ４００ ｍ點）、湖北省神農(nóng)架林區(qū)、河南省內(nèi)鄉(xiāng)縣夏關(guān)鎮(zhèn)、河南省淅川縣桐油鎮(zhèn)、廣西壯族自治區(qū)桂林市、浙江省磐安縣、安徽省寧國市等７個不同產(chǎn)地的成熟種子。

１．２ＴＴＣ染色方法

１．２．１ＴＴＣ溶液配制用去離子水分別將ＴＴＣ配成１、３、５ ｇ／Ｌ濃度的溶液，ｐＨ值范圍為６．８～７．２，避光保存。

１．２．２浸泡處理取各產(chǎn)地白花前胡種子樣品，均為200粒，在３０ ℃的自來水里浸泡一定時間，然后用刀片沿種子胚的中心線將種子縱切為二，使其露出胚，以供染色所用。

１．２．３染色將剖開胚的５０粒種子放入培養(yǎng)皿中，加入配制好的ＴＴＣ溶液，放入３５ ℃恒溫箱中避光染色［５，６］，重復(fù)４次。到達(dá)規(guī)定的染色時間后，取出種子，并用自來水反復(fù)沖洗若干次后，用放大鏡觀察胚著色程度和染色部位，以此判斷白花前胡種子生活力強(qiáng)弱。

１．３ＴＴＣ法最佳測定條件的選擇

不同植物的種子，用ＴＴＣ法測定生活力時，其適宜的設(shè)置條件各不相同，一般浸種時間、ＴＴＣ濃度和染色時間對種子生活力測定的影響較大。為確定白花前胡種子生活力的最佳測定條件，試驗選用產(chǎn)地為浙江省磐安縣的白花前胡種子，采用正交試驗Ｌ９（３３）設(shè)計方法比較各種因素對白花前胡種子生活力的影響。所選擇的各因素、各水平見表１，每５０粒種子為１組處理，重復(fù)４次。對試驗所得數(shù)據(jù)采用ＳＰＳＳ １６．０軟件進(jìn)行分析處理，以確定出體現(xiàn)白花前胡種子最強(qiáng)生活力的條件。

１．４不同產(chǎn)地、不同粒徑種子ＴＴＣ法測定的種子生活力比較

選擇湖北省長陽縣（低海拔點、海拔８００ ｍ點、海拔１ ４００ ｍ點）、湖北省神農(nóng)架林區(qū)、河南省內(nèi)鄉(xiāng)縣夏關(guān)鎮(zhèn)、河南省淅川縣桐油鎮(zhèn)、廣西壯族自治區(qū)桂林市、安徽省寧國市等６個不同產(chǎn)地的成熟白花前胡種子，分別將其過１０目、１２目、１４目種子篩，得到不同粒徑的種子，再分別用ＴＴＣ法測定白花前胡種子的生活力，進(jìn)行不同產(chǎn)地、不同粒徑種子的生活力比較。

２結(jié)果與分析

２．１ＴＴＣ法測定白花前胡種子生活力的最佳條件

采用四唑染色法測定白花前胡種子生活力的正交試驗Ｌ９（３３）設(shè)計結(jié)果見表２，所得數(shù)據(jù)用ＳＰＳＳ １６．０軟件進(jìn)行方差分析的結(jié)果見表３。通過統(tǒng)計分析，可知浸種時間、染色液濃度、３５ ℃恒溫時染色時間３個因素的Ｐ值均小于０．０５，說明各因素不同水平間具有顯著性的差異，３個因素對白花前胡種子生活力的影響大小排序為染色液濃度＞３５ ℃恒溫時染色時間＞浸種時間。對各試驗因素不同水平的種子生活力平均值進(jìn)行比較，結(jié)果如表４。由表４結(jié)果分析可知，浸種時間過長會導(dǎo)致白花前胡種子生活力下降，試驗的浸種時間以浸種１０ ｈ的白花前胡種子生活力最高，其與浸種時間８、１２ ｈ處理的種子生活力差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）；ＴＴＣ液濃度越高，白花前胡種子的生活力越低，當(dāng)ＴＴＣ液濃度為１ ｇ／Ｌ時，白花前胡種子的生活力最高，其與３、５ ｇ／Ｌ ＴＴＣ液濃度處理的種子生活力差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）；ＴＴＣ液染色時間短的白花前胡種子生活力較低，以染色時間１６ ｈ的為最佳，其與８、１２ ｈ染色處理的種子生活力差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。綜上所述，ＴＴＣ法測定白花前胡種子生活力的最佳條件為將種子在恒溫３０ ℃下、于自來水中浸種１０ ｈ后，用刀片沿種子胚的中心線縱切為二，取其中胚比較完好的一半放入１ ｇ／Ｌ ＴＴＣ溶液中，３５ ℃恒溫避光染色１６ ｈ。

２．２不同產(chǎn)地、不同粒徑對白花前胡種子生活力的影響

為進(jìn)一步考察不同產(chǎn)地、不同粒徑大小的白花前胡種子之間生活力的差異情況，選擇６個不同產(chǎn)地的種子，并分別將其分為１０目，１２目，１４目３個粒徑規(guī)格，在前述ＴＴＣ法最佳條件下測定種子生活力，每５０粒為１組，重復(fù)３次，測定結(jié)果見表５，用ＳＰＳＳ １６．０軟件對不同產(chǎn)地和不同粒徑的白花前胡種子生活力進(jìn)行雙因素方差分析，結(jié)果見表６。分析結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的白花前胡種子生活力的差異不顯著（Ｐ＞０．０５），而不同粒徑的白花前胡種子生活力存在著極顯著水平的差異（Ｐ＜０．０１），且生活力高低排序為１０目＞１２目＞１４目。

３小結(jié)與討論

１）試驗前期對ＴＴＣ法測定白花前胡種子生活力的染色溫度和ＴＴＣ液濃度做了簡單對比，結(jié)果表明，染色溫度低于３０℃和ＴＴＣ液濃度高于５ ｇ／Ｌ時，白花前胡種子不染色或染色情況極差，故試驗考察生活力的溫度設(shè)置在３５ ℃左右，ＴＴＣ液濃度在５ ｇ／Ｌ以下。

２）試驗對ＴＴＣ法測定白花前胡種子生活力進(jìn)行了正交試驗分析，結(jié)果表明不同浸種時間，不同ＴＴＣ液濃度，不同染色時間均對白花前胡種子生活力產(chǎn)生顯著的影響。最佳條件為將種子在恒溫３０ ℃下自來水中浸泡１０ ｈ后，用濃度為１ ｇ／Ｌ的ＴＴＣ液在３５ ℃恒溫條件下避光染色１６ ｈ。

３）試驗采取最佳條件測定了不同產(chǎn)地，不同粒徑大小的白花前胡種子生活力，并對其進(jìn)行了雙因素方差分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地白花前胡種子生活力的大小并沒有明顯的地域差異；但不同粒徑大小的白花前胡種子生活力差異達(dá)到了極顯著水平。導(dǎo)致這種差異的產(chǎn)生，可能是因為胚的大小與種子生活力的強(qiáng)弱具有一定的聯(lián)系，胚形體大的種子生活力要強(qiáng)于胚形體小的，而ＴＴＣ法測定生活力是觀察種子胚的染色情況，不同粒徑大小的種子其胚的大小也存在差異；一般來講，粒徑大的種子胚形體相對粒徑比它小的種子胚形體要大一些，所以不同粒徑大小的種子的生活力強(qiáng)弱有差異存在。

參考文獻(xiàn)：

［１］ 陳瑛． 實用中藥種子技術(shù)手冊［Ｍ］．北京： 人民衛(wèi)生出版社，１９９９． ３４－３５．

［２］ 史周華，張雪飛． 中醫(yī)藥統(tǒng)計學(xué)［Ｍ］．北京：科學(xué)出版社，２００９． １３４－１５６．

［３］ 國際種子檢驗協(xié)會（ＩＳＴＡ）． １９９６國際種子檢驗規(guī)程［Ｍ］． 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社，１９９９．

［４］ 郭巧生． 藥用植物栽培學(xué)［Ｍ］． 北京：高等教育出版社，２００４．５２．

［５］ 喻方圓，唐燕飛．四唑染色法快速測定任豆種子生活力的研究［Ｊ］． 種子，２００４，23（７）：４０－４２．

［６］ 沈宇峰，王志安，俞旭平，等． 白術(shù)種子生活力測定方法及其與發(fā)芽率的相關(guān)性研究［Ｊ］． 中國中藥雜志，２００８，３３（３）：２４８．