羅漢果中活性成分的高效液相色譜測定與指紋圖譜研究

摘要：建立了高效液相色譜法測定羅漢果藥材的指紋圖譜，并用該方法對羅漢果中的指紋峰進行了分析。結果表明，該方法對羅漢果指紋圖譜進行分析的穩定性好、精密度高、重復性高，可用于羅漢果的鑒別及質量控制。

關鍵詞：羅漢果；指紋圖譜；ＨＰＬＣ；質量控制

中圖分類號：Q949.782.06；Ｏ６５７．７＋２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3826-03

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｉｎ Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ ｂｙ ＨＰＬＣ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ

ＺＨＡＮＧ Ｗｅｎ－ｑｉｎｇ

（Ｇｕａｎｇｘｉ Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ ＆ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００３，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｏｆ Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＨＰＬＣ． Ｔｈｅ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ ｐｅａｋｓ ｉｎ Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ ｗere ａｎａｌｙｚｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｗａｓ ａ ｓｔａｂｌｅ， ｐｒｅｃｉｓｅ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ of Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｇａｒｃｉｎｉａ ｍａｎｇｏｓｔａｎａ； ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ； ＨＰＬＣ； ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ

中藥羅漢果（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）是葫蘆科羅漢果屬植物［Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ （Ｓｗｉｎｇｌｅ） Ｃ． Ｊｅｆｆｅｒｙ］的成熟果實。性涼味甘，具有清熱解渴，潤肺止咳之效，可用于治療喉痛、慢性咽喉炎、咽喉失音、慢性支氣管炎、哮喘、百日咳、高血壓、便秘病癥等［１］。它所含的活性成分羅漢果甙可作為糖尿病人、高血壓病人、齲齒患者的補助藥物，因此臨床應用價值較高。筆者采用高效液相色譜法對羅漢果藥材指紋圖譜進行了研究，分析了ＧＡＰ基地羅漢果藥材的指紋圖譜相似度，為羅漢果藥材質量的控制提供有效方法［２］。

１材料與方法

１．１儀器

高效液相色譜儀（ＥａｓｙＳｅｐＴＭ－１０１０，上海通微分析技術有限公司）；色譜工作站（ＳＤ－２０２０，北京華博科技制造有限公司）；紫外檢測器（ＥＭＣ－ＵＶ１０，北京艾美林科技有限公司）；中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統的操作規范（版本２００４Ａ）［３］；分析天平（Ｓａｒｔｕｒｉｕｓ－ＢＳ１１０Ｓ，北京賽多利斯天平有限公司）。

１．２試劑

去離子水，乙腈（色譜純），甲酸、無水乙醇（分析純），羅漢果甙對照品，上述試劑均購于中國藥品生物制品檢定所。羅漢果樣品收集來自廣西永福ＧＡＰ基地，且經省藥品檢驗所鑒定。

１．３對照品溶液制備

精確稱取適量羅漢果甙對照品，然后溶解于５０％（體積比）甲醇溶液中制成含量為１．０ ｍｇ／ｍＬ的對照品溶液備用。

１．４樣品提取

將樣品置于６０ ℃烘箱內干燥１ ｈ，粉碎，過篩，再精確稱取２．５ ｇ干燥樣品溶于５０ ｍＬ去離子水中，回流提取２ ｈ后，過濾，在殘渣中再加入去離子水３０ ｍＬ后繼續回流２ ｈ，合并兩次濾液，濃縮至２０ ｍＬ后加入 ８０ ｍＬ無水乙醇，將上述溶液避光２４ ｈ后，過濾，收集濾液，再減壓去除乙醇至無醇味，收集濃縮液，定容至２５ ｍＬ，即得供試品提取液［3，4］。

１．５ＨＰＬＣ指紋圖譜的建立

１．５．１ＨＰＬＣ條件色譜柱Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＶＰ－ＯＤＳ柱；流動相為含０．１％（體積比）甲酸的乙腈（Ａ）和去離子水（Ｂ）；梯度洗脫０～３０ ｍｉｎ：Ａ ２０％～４０％（體積比，下同）；３０～５５ ｍｉｎ：Ａ ４０％～８５％；５５～６０ ｍｉｎ：Ａ ８５％；檢測波長設為２５４ ｎｍ；流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；進樣量２０ μＬ；柱溫為２５ ℃［6］。

１．５．２穩定性試驗將同一批次樣品提取液分別放置０、１、２、４、８、１０和２４ ｈ后，注入高效液相色譜儀，比較色譜峰保留時間，進行穩定性分析［6］。

１．５．３精密度試驗連續６次將同一供試品溶液注入高效液相色譜儀，進行精密度分析［7］。

１．５．４方法重復試驗先取同一批次的羅漢果，分別按１．４所述方法制備６份供試品提取液，對其進行高效液相色譜的重復性分析［6］。

１．５．５樣品測定及共有指紋峰的確定取ＧＡＰ基地羅漢果藥材１０批，每批２份，按１．４所述方法分別制成供試品提取液，并以高效液相色譜進行分析［7－9］。

２結果與分析

２．１穩定性

不同時間段各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的ＲＳＤ均小于３％，各指紋圖譜的相似度均為１．０００，見表１。從表１可知，該法能較好滿足了色譜指紋圖譜研究的技術要求。

２．２精密度

各次進樣共有峰的相對保留時間和相對峰面積的ＲＳＤ均小于３％，各指紋圖譜的相似度均為１．０００，見表２。從表２可見，本方法精密度高，較好地滿足了色譜指紋圖譜研究的技術要求。

２．３重復性

對各次進樣共有峰相對保留時間和相對峰面積的ＲＳＤ均小于３％，各指紋圖譜的相似度均為１．０００，見表３。從表３可見，本方法可重復性高，較好地滿足了色譜指紋圖譜研究的技術要求。

２．４共有指紋峰的確定

各批次羅漢果樣品的指紋圖譜色譜峰均于４０ ｍｉｎ內出現，共分離出１８個峰，其中有６個峰峰面積占總峰面積均達９０％以上，因此可以確定這６個峰是羅漢果樣品所共有指紋峰（見圖１）。

３小結

本研究參照原國家藥品監督管理局頒布的《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》，采用ＨＰＬＣ法指紋圖譜的分析方法對不同產地羅漢果藥材進行指紋圖譜分析，構建了羅漢果藥材對照指紋圖譜，羅漢果藥材中的有效成分能在色譜圖中得到充分體現，所建立的色譜指紋圖譜具有較好穩定性和可控性，可用于羅漢果藥材質量控制。此外，本研究所建立的方法操作簡單、重現性好，為羅漢果藥材的質量評價及含羅漢果制劑的指紋圖譜研究提供了參考。該指紋圖譜可代表羅漢果的指紋特征，可用于羅漢果的鑒別及藥材質量控制，以供質控部門借鑒與參考。

參考文獻：

［１］ 中華人民共和國藥典委員會．中華人民共和國藥典［Ｍ］． 北京：中國醫藥科技出版社，２０００．２２０－２２１．

［２］ 韋素玲，黃姿梅，楊華，等． 羅漢果性別相關ＲＡＰＤ標記的克隆與序列分析［Ｊ］． 湖北農業科學，２００８，４７（３）：２５１－２５３．

［3］ 黎海彬，王邕，白先放，等． 微波輻射對羅漢果提取物中活性成分的影響［Ｊ］． 精細化工，２００６，２３（３）：２６５－２７０．

［4］ 楊洋，羅玉蓮，劉翀． 羅漢果抗氧化活性成分的提取工藝研究及其含量測定［Ｊ］． 工藝技術，２００４，２５（３）：７０－７２．

［5］ 黃飛，梁智群． 對羅漢果中多糖活性成分的分離提取及純化研究［Ｊ］．廣西輕工業， ２００７，２３（７）：１０－１１．

［6］ 國家藥品監督管理局．中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）［Ｓ］．２０００．

［7］ 路安民，張志耕．中國羅漢果植物［Ｊ］． 廣西植物，１９８４，４（１）：２７－３３．

［8］ 周兢，王夢月，李曉波，等． ＨＰＬＣ法測定羅漢果中羅漢果苷Ｖ和１１－氧化羅漢果苷Ｖ ［Ｊ］． 中草藥，２００７，３８（２）：１９６－１９８．

［9］ 劉金磊，李典鵬，黃永林． 桂北地區不同品種、不同產地鮮羅漢果中總甙、甙Ｖ含量測定［Ｊ］．廣西植物，２００７，２７（２）：２８１－２８４．