嘧肽霉素一種新的生物活性組分分離純化研究

摘要：通過生物活性檢測發現Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｚ９２菌株嘧肽霉素發酵液中一種新的抗細菌生物活性物質，為了明確其適宜的分離純化工藝，試驗研究了利用大孔吸附樹脂，硅膠柱層析和分子篩層析分離純化該組分的條件和效果。試驗結果顯示，發酵液經過大孔樹脂ＳＰ８２５Ｌ吸附５０％甲醇洗脫、硅膠柱層析氯仿∶正丁醇∶甲醇∶乙酸＝42∶2∶4∶2（體積比）洗脫、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０ ７０％甲醇洗脫可以得到該組分純品。

關鍵詞：嘧肽霉素；分離純化；生物活性

中圖分類號：Ｓ４８２．２；Ｒ９７８．７文獻標識碼： Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3728-04

Isolation and Purification of A New Bio-active Ingredient in Cytosinpeptidemycin Fermentation Broth

ＭＵ Ｌｉｎｇ－ｘｉａｏ，ＦＵ Ｙｉｎｇ，ＺHAO Ｘｉｕ－ｘｉａｎｇ，ＷU Ｙｕａｎ－ｈｕａ

（College of Plant Protection，Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｒｕａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ new ａｎｔｉ－ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｉｏ－ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｎ Ｃｙｔｏｓｉｎｐｅｐｔｉｄｅｍｙｃｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｂｙ ｂｉｏａｓｓａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｐｒｏｐｅｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ， ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｅｖｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅ ｒｅｓｉｎ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｃould ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰ８２５Ｌ ａｎｄ ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ ５０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ， ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ∶ １－ｂｕｔａｎｏｌ ∶ ｍｅｔｈａｎｏｌ ∶ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ＝42∶2∶4∶２（ｂｙ ｖｏｌ．）， Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０ ７０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Cytosinpeptidemycin； isolation and purification； bio-activity

自從２０世紀４０年代青霉素問世以來，抗生素的研究和應用引起了人們極大的興趣，陸續開發出了一系列針對人類和動物疾病的抗生素品種，其影響也逐漸涉及到農業及其他領域。最早研究農用抗生素的是美國和歐洲，隨后日本迅速崛起，并形成了四大新農用抗生素品種——滅瘟素Ｓ、春日霉素、多氧霉素和有效霉素，在農業生產中得到廣泛應用［１－３］。

嘧肽霉素是由土壤中分離篩選出來的不吸水鏈霉菌遼寧變種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ ｖａｒ．ｌｉａｏｎｉｎｇｅｎｓｉｓ）產生的次生代謝產物［４］，可作為一種新型、高效的抗病毒［５－８］和抗真菌［９］生物農藥。目前已經報道的２種從嘧肽霉素產生菌發酵液中分離的具有抗病毒作用的物質［１０，１１］，都是胞嘧啶核苷肽類化合物。沈陽農業大學植物保護學院植物病毒實驗室以煙草赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）為頡頏對象進行篩選，新發現了一種生物活性物質。本研究明確了分離方法，為進一步確定該物質的結構、生物功能和應用研究奠定了基礎。

１材料與方法

１．１儀器

慧德易Ｑｕｉｃｋｓｅｐ ５０ 中壓層析系統，Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ／ＭＳＤ Ｔｒａｐ型液質聯用系統； ＤＩＫＭＡ ＤｉａｍｏｎｓｉｌⅡ Ｃ１８反相柱（４．６ ｍｍ×２０ ｍｍ，５ μｍ）； ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ２５紫外可見分光光度計；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｒｎｓｔｅａｄ Ｎａｎｏｐｕｒｅ超純水系統。

１．２菌種和培養基

菌種：嘧肽霉素產生菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｚ９２，分離指示菌為煙草赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ），均由沈陽農業大學植物保護學院植物病毒實驗室分離保存。

斜面和平板培養基：煙草赤星病菌培養基（牛肉膏３ ｇ，蛋白胨３ ｇ，磷酸氫二鈉０．１ ｇ，瓊脂粉１７ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，滅菌前ｐＨ值７．８）；高氏麥麩培養基（麩皮１０ ｇ，可溶性淀粉１３．３ ｇ，葡萄糖６．７ ｇ，ＮａＣｌ ０．５ ｇ，ＭｇＳＯ４ ０．５ ｇ，ＫＮＯ３ １ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．５ ｇ，ＦｅＳＯ４ ０．００ ５ ｇ，瓊脂粉２５ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ ，ｐＨ值７．０～７．２）；發酵培養基：可溶性淀粉４７ ｇ，花生餅粉２２ ｇ，酵母粉２ ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４２．７ ｇ，ＮａＣｌ２．７ ｇ， ＣａＣＯ３ ２．７ ｇ，去離子水１ ０００ ｍＬ，ｐＨ值７．２。所有培養基均１２１ ℃滅菌３０ ｍｉｎ備用。

１．３試驗方法

１．３．１菌株發酵粗提液制取菌株的發酵采用二級發酵，無菌條件下，用無菌水制成菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｚ９２的孢子懸浮液，高氏麥麩培養基上每皿加入０．５ ｍＬ菌懸液，鏟刮均勻，置于２８ ℃恒溫培養箱中培養４ ｄ，待菌落表面顏色變為深灰色，表明大部分孢子已成熟，即可用于發酵。將培養皿中菌株Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔｚ９２孢子刮下，配成約為１×１０８個／ｍＬ的孢子懸浮液。２５０ ｍＬ三角瓶裝發酵培養基４０ ｍＬ，接孢子懸浮液４ ｍＬ，用透氣封口膜封口，２８ ℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養９６ ｈ。４ ０００ ｒ／ｍｉｎ常溫離心１５ ｍｉｎ，草酸酸化得到的發酵液上清液至ｐＨ值為３，６０ ℃水浴６ ｈ，充分沉淀雜質，冷卻至室溫，濾除雜質，即為粗提液。

１．３．２大孔樹脂提取活性物質供試樹脂分別為ＳＰ８２５Ｌ、ＨＰ２０、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ７ＨＰ。

１）樹脂預處理。將樹脂用無水乙醇浸泡２４ ｈ，充分溶脹，沉淀后棄去細小顆粒及破碎樹脂，再用去離子水反復洗滌，直到完全洗去醇味。

２）靜態吸附。將粗提液分別調ｐＨ值至３、６、９。稱取處理好并濾除水分的濕樹脂３ ｇ，裝入三角瓶中，分別加入３０ ｍＬ不同ｐＨ值的粗提液，搖床振搖（６０ ｒ／ｍｉｎ，２５ ℃）２ ｈ，然后取吸附余液調整ｐＨ值至６，進行生物活性測定，以粗提液為對照，試驗設３個重復。

３）洗脫。取靜態吸附中效果最好的處理，完全傾去吸附余液，將樹脂平均分成３份，分別加入１０ ｍＬ的５０％（體積比，下同）甲醇，５０％乙醇和５０％ 丙酮溶液，置搖床振搖（６０ ｒ／ｍｉｎ，２５ ℃，２ ｈ）洗脫，然后取洗脫液去除有機溶劑并定容至原體積，調整ｐＨ值至６，測定生物活性。以粗提液為對照，試驗設３個重復。

４）制取濃縮液。將靜態吸附中篩選并處理好的大孔樹脂濕法裝柱，柱床高３０ ｃｍ，直徑２．２ ｃｍ。用去離子水平衡３～５個柱床體積（ＢＶ），并用ｐＨ值為３的鹽酸溶液平衡１ ＢＶ調整柱床ｐＨ值。將粗提液ｐＨ值調為３，上樣８０ ｍＬ，流速１ ｍＬ／ｍｉｎ。上樣結束后，用去離子水沖洗８０ ｍｉｎ，流速２ ｍＬ／ｍｉｎ。然后樹脂用５０％甲醇洗脫，流速１ ｍＬ／ｍｉｎ，洗脫３ ＢＶ后用５０％丙酮再生柱床。上樣開始記錄色譜圖，檢測波長為２５４ ｎｍ。分管收集，５ ｍＬ／管，測定各管生物活性，收集活性峰，減壓濃縮去除有機溶劑，４ ℃冰箱保存。

１．３．３硅膠柱層析提取純化

１）薄層層析確定最佳流動相。取１０ ｃｍ×２０ ｃｍ

Ｍｅｒｃｋ層析板，以大孔吸附樹脂洗脫的活性濃縮液為樣品，點樣量５０ μL，距層析板底部２ ｃｍ將樣品用毛細管均勻點于薄板，風機吹干，少量多次重復，讓樣品帶盡量窄。點樣后放入預先配好的至少飽和３０ ｍｉｎ的展開劑中，上行法密閉展層，展開距離１７ ｃｍ。展層完畢后，取出風機吹干，檢測展層效果和各條帶的抑菌活性。

檢測方法采用熒光顯影法。將展層后的薄板放在紫外燈下觀察，２５４ ｎｍ波長下檢測，用鉛筆標記暗色條帶，取出后測量并計算Ｒｆ值。

活性追蹤測定采用生物顯影法。將暗帶用刀片輕輕刮下，壓碎成均勻粉末狀，放入牛津杯中，２８ ℃恒溫培養４８ ｈ，觀察各條帶抑菌圈的有無及大小，確定具有活性的條帶。

２）硅膠柱層析。干法裝柱，干法上樣。柱床高３０ ｃｍ，直徑１．６ ｃｍ。用配好的流動相以２ ｍＬ／ｍｉｎ的流速過柱，洗脫液流出色譜柱后開始記錄色譜圖，檢測波長２５４ ｎｍ，分管收集。按色譜圖中峰的情況合并相同峰對應的收集液，減壓蒸干，測生物活性。

１．３．４Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０分子篩層析提取純化按照說明書的要求裝柱并平衡，柱床高８０ ｃｍ，直徑１．６ ｃｍ。取適量硅膠柱層析后得到的干物質，溶于７０％甲醇，上樣，流動相７０％甲醇，流速０．２ ｍＬ／ｍｉｎ，上樣后開始記錄色譜圖，檢測波長２５４ ｎｍ。測生物活性。

２結果與分析

２．１大孔樹脂洗脫劑和洗脫條件的確定

不同樹脂對發酵液中活性成分的吸附情況見表１。供試的４種大孔樹脂中，ＳＰ８２５Ｌ和ＸＡＤ１６對發酵液中的活性物質吸附性能相當，在３種不同的吸附條件下，其吸附余液的抑菌圈直徑均小于其他樹脂吸附余液的抑菌圈直徑，且在ｐＨ值為３時吸附效果最佳。ＳＰ８２５Ｌ、ＨＰ２０和ＸＡＤ１６具有相似的基材結構，但ＨＰ２０孔徑較大，比表面積小，因此選擇性不強。ＸＡＤ７ＨＰ 可能是因為極性較強不適合目標物質。ＳＰ８２５Ｌ和ＸＡＤ１６對活性成分吸附性能相當，但前者有更小的粒徑和更均勻的孔徑，吸附洗脫時可以獲得更好的分離性能，因此將ＳＰ８２５Ｌ作為下步試驗的吸附劑，吸附條件為ｐＨ值為３，常溫吸附。

在用３種洗脫劑進行的洗脫試驗中，５０％甲醇、５０％乙醇和５０％丙酮均能很好的對ＳＰ８２５Ｌ有效成分進行洗脫，且效果相當。但甲醇洗脫后的樹脂仍有色素殘留，丙酮洗脫更加徹底。考慮到甲醇價格低廉且無紫外線吸收，便于在洗脫過程中進行監測，故選用５０％甲醇作為洗脫劑，而用５０％丙酮作為洗脫后的再生劑。

２．２大孔樹脂動態吸附法提取抗生素

由大孔樹脂吸附洗脫的色譜圖（圖１）可見，在上樣和洗脫（０～１６０ ｍｉｎ）時即有大量不吸附成分穿柱流出，表明在此已經去除了一部分雜質。開始洗脫后紫外線吸收可以監測到幾個較為明顯的吸收峰，抑菌試驗表明只有２１０～２８０ ｍｉｎ的吸收峰有抑菌活性，可見可以用洗脫液的紫外線吸收情況來監測抑菌活性物質的洗脫進程。在經過大孔樹脂吸附后，有效成分被純化和富集，反復收集大孔樹脂吸附洗脫液，經旋轉蒸發濃縮，作為下步分離的試材。

２．３薄層層析展層劑篩選結果

薄層層析法設備簡單，操作方便，可用于化合物的分析和少量制備，也可以用于篩選硅膠柱層析的合適流動相組成。試驗選擇Ｍｅｒｃｋ層析板作為固定吸附劑，５種溶劑系統作為供試展開劑，采用上行展層法對粗提液進行薄層層析分離，分離情況見表２。

各溶劑系統展層后，熒光顯影與生物顯影的結果表明，展層劑１分離出１個條帶，無抑菌活性；展層劑２分離出２個條帶，無抑菌活性；展層劑３、４、５均分離得到５個條帶，有活性條帶分別為ｃ、ｄ、ｅ。因為硅膠柱層析不同于薄層層析，是一個多次爬板的過程，篩選的展層劑應使活性成分的Ｒｆ值在０．３左右，據此展層劑５可作為硅膠柱層析用流動相。

２．４硅膠柱層析結果

應用２．３中篩選的展層劑比例配制流動相進行硅膠柱層析，色譜圖（圖２）中可以看出，大孔樹脂分離后的洗脫液成分仍然很復雜，在經過硅膠柱層析之后不同成分得到了比較有效的分離，活性成分在１１８～１３８ ｍｉｎ時流出，與紫外線吸收峰對應，起到了很好的分離純化效果。因為硅膠多為一次性使用，并且活性成分流出時間較早，這就可以在收集活性成分后停止洗脫，以減少溶劑消耗，節約成本。

２．５Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０分子篩層析分離結果

Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０分子篩層析作為整個分離過程最后的精制手段，它利用葡聚糖凝膠的分子篩效應、反相分配作用和氫鍵相互作用對不同物質進行分離。經過硅膠柱層析的活性組分在通過Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０分子篩層析后被分成３個主要峰，其中７００～７６０ ｍｉｎ出現的峰有抑菌活性。從色譜圖（圖３）可見，活性成分與其他雜質峰分得較開，且峰形良好。收集此峰進行ＬＣ／ＭＳ分析，色譜圖呈現單一峰，該峰對應的累積質譜圖如圖４，圖中ＥＳＩ－ＭＳ（ｐｏｓ．），ｍ／ｚ：２４５．２［Ｍ＋Ｈ］＋為基峰，推測ｍ／ｚ：２６７．２０ ［Ｍ＋Ｎａ］＋為基峰的加鈉峰，有效成分相對分子質量為２４４．２。此組分主要由一相對分子質量約為２４４的分子組成，純度較高，可以用于進一步結構測定。

３討論

生物農藥在生產應用過程中必須對其構效關系有清楚的認識，只有通過一系列的分離純化技術將有效成分純化出來，才能消除干擾、正確分析結構與功能等。微生物產生的活性物質的分離和提純工藝復雜，由于不同菌株所產生的活性成分性質不同，在發酵液中的存在形式及受雜質的干擾情況不一，所以沒有一個統一的規范化的分離提純模式。即使是同一種抗生素，也常因生產菌株、培養基成分、發酵水平和培養條件的差異而采用不同的提純工藝。早期試驗已明確嘧肽霉素含有多個有效組分，并獲得了部分組分的純品，這為新組分分離提供了重要參考。試驗采用了大孔樹脂ＳＰ８２５Ｌ富集純化、硅膠柱層析進一步分離和Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０分子篩精細分離的純化路線，整合了大孔樹脂高通量、硅膠柱層析操作簡便和Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０分子篩分離度高的特點，兼顧成本和效率因素，形成了基本的分離路線，但仍有多處尚待改進。如在用大孔樹脂分離過程中，可以考慮用２０％～５０％梯度洗脫代替等度洗脫，以充分發揮ＳＰ８２５Ｌ均勻小孔徑的高分離度優勢；硅膠柱層析時尋找可替代氯仿的展層劑以減少有毒物質的用量；Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ－２０分子篩加大流速并嘗試過載上樣來提高純化效率。試驗為新組分純化富集并進行后續的結構測定研究奠定了基礎。

參考文獻：

［１］ 張寧波． 農用抗生素研究進展［Ｊ］． 湖北農業科學，２００６（６）：８３０－８３３．

［２］ 余鳳玉，李振華，曾會才． 抗真菌農用抗生素的研究進展［Ｊ］． 熱帶農業科學，２００５（１）：６０－６５．

［３］ 朱昌雄，蔣細良． 我國農用抗生素的研發現狀及其進展［Ｊ］． 現代化工，２００４（１０）：１－４．

［４］ 朱春玉． 嘧肽霉素抗煙草花葉病毒（ＴＭＶ）作用機制研究［Ｄ］． 沈陽：沈陽農業大學，２００５．

［５］ 朱春玉，吳元華，王春梅，等． 嘧肽霉素對煙草花葉病毒抑制作用研究［Ｊ］．植物保護，２００５（４）：５３－５５．

［６］ 朱春玉，吳元華，趙秀香，等． 嘧肽霉素對煙草花葉病毒在不同寄主上的防效研究［Ｊ］． 遼寧大學學報（自然科學版），２００７（１）：５０－５３．

［７］ 趙秀香，吳元華，杜春梅，等． 新型農藥嘧肽霉素防治番茄病毒病藥效［Ｊ］． 農藥，２００４（１２）： ５３４－５３６．

［８］ 朱春玉，吳元華，趙秀香，等． 嘧肽霉素抗煙草花葉病毒作用機理初步研究［Ｊ］．植物病理學報，２００６（４）：３１４－３１６．

［９］ 白建保，宋影， 趙秀香． 嘧肽霉素對煙草赤星病菌的抑制作用［Ｊ］． 安徽農業科學，２００７（１０）：２９９３－２９９５．

［１０］ 王艷紅，吳元華，朱春玉，等． 嘧肽霉素又一抗病毒活性成分的研究［Ｊ］．沈陽農業大學學報，２００６（１）：４４－４７．

［１１］ 王艷紅，吳元華，朱春玉，等． Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０大孔吸附樹脂與薄層層析法分離提取嘧肽霉素［Ｊ］． 黑龍江八一農墾大學學報，２００５（４）：２２－２５．