蕨類植物石蠟切片制作技術探討

摘要：石蠟切片是一種常規的生物組織形態結構研究手段。由于蕨類植物不同世代的樣本具有顯著差異，僅依常規流程進行石蠟制片與切片，往往不能達到預期的效果。在實際操作中，操作者會遇到一些書本上沒有答案的難題，從而影響試驗的進程與操作。試驗以荷葉鐵線蕨（Ａｄｉａｎｔｕｍ ｒｅｎｉｆｏｒｍｅ Ｌ． ｖａｒ． ｓｉｎｅｎｓｅ Ｙ．Ｘ．Ｌｉｎ）為材料，探討了蕨類植物石蠟切片的制作流程，并針對在常規石蠟切片中易出現的問題進行了探討，提出了相應的解決方法。

關鍵詞：石蠟切片；蕨類植物；荷葉鐵線蕨

中圖分類號：Ｑ－３３６；Ｑ９４９．３６＋７．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3767-03

Study on the Technique of Making Paraffin Section of Fern

ＷＵ Ｈｕａ，ＣＨＥＮ Ｐｉｎｇ－ｔｉｎｇ，ＹＵＡＮ Ｌｉｎｇ，ＸＵ Ｙｏｎｇ-ｒｏｎｇ，ＣＨＥＮ Ｌｏｎｇ－ｑｉｎｇ

（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ， ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｕｓｕａｌｌｙ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｔｕｄｉｅｓ． Ｈａｎｄ ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｒｏｕｔｉｎｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ， ｂｕｔ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｍｉｇｈｔ ｎｏｔ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ ｆｅｒｎｓ． Ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｒｅｔｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ， ｓｏｍｅ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｍｅｎｔｉｏｎｅｄ ｉｎ ｂｏｏｋｓ ｍｉｇｈｔ ｄｉｓｔｕｒｂ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ． The ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ of making paraffin section was simplified ｕｓｉｎｇ Ａｄｉａｎｔｕｍ ｒｅｎｉｆｏｒｍｅ Ｌ． ｖａｒ． ｓｉｎｅｎｓｅ Ｙ．Ｘ．Ｌｉｎ ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｓｏｍｅ ｃｏｍｍｏｎ ｐｒｏｂｌｅｍｓ and corresponding solution ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｏｕｔｉｎｅ ｗａｙ were put forward．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ； ｆｅｒｎ； Ａｄｉａｎｔｕｍ ｒｅｎｉｆｏｒｍｅ Ｌ． ｖａｒ． ｓｉｎｅｎｓｅ Ｙ． Ｘ． Ｌｉｎ

石蠟切片是進行動植物形態發育和內部構造研究的重要技術與手段［１－４］。一張結構完整、厚薄適當、平整、染色清晰、反差強、透光性好的高質量石蠟切片的獲得，與整個石蠟切片制作過程中的各個環節都有著緊密的聯系。不同的材料有著不同的特性，在具體制作時，針對不同的材料需要摸索和探討相應的處理時間與條件，不斷地改進和完善。除此以外，在具體的操作中還有許多的注意事項或技巧，如固定材料抽真空時，如何使材料保持在固定液內，不因劇烈的壓強變化而使細胞或結構受損；如何避免在固定和脫水換液過程中，空氣又回到組織結構間隙較大的材料里；如何快速高效的使蠟帶展平，等等。蕨類植物是介于低等植物與高等植物之間的過渡型植物群體，它的生長和發育模式對研究植物的進化與起源有著重要的意義和價值。早在２０世紀５０年代初，人們就開始對蕨類植物配子體的形成和發育進行了大量的顯微觀察研究。但是國內有關如何具體的制作蕨類植物石蠟切片的文章報道甚少，教科書中也較少提及。荷葉鐵線蕨（Ａｄｉａｎｔｕｍ ｒｅｎｉｆｏｒｍｅ Ｌ． ｖａｒ． ｓｉｎｅｎｓｅ Ｙ．Ｘ．Ｌｉｎ）是我國特有的瀕危保護植物，僅分布于長江三峽流域的少數地區［５，６］，具有配子體含水量高、孢子體葉片革質、走莖表面附屬物多等特點，按常規的制片方法，難以獲得符合質量要求的切片［７，８］。試驗以荷葉鐵線蕨為材料，基于常規的石蠟切片技術，根據對比試驗改善了石蠟切片制作基本流程中的一些操作環節，并對一些常見的問題提出了具體可行的解決方法，現將結果報告如下。

１材料與方法

１．１材料

植物材料為荷葉鐵線蕨原葉體、原葉體愈傷組織、孢子體葉片、走莖、根等。試劑主要有純石蠟、ＦＡＡ固定液（含５０％或７０％的乙醇）、無水乙醇、乙醇（分析純）、１％醇溶性伊紅、氯仿、二甲苯、蛋清甘油、加拿大樹膠、國產中性樹脂等。儀器主要有展片臺、恒溫烘箱、生物顯微鏡、真空儀等。

１．２方法

１．２．１固定常規的固定是將所需器官或組織剪切好后，投入裝有約為材料體積２０倍的ＦＡＡ固定液的安瓿瓶中（規格為１０ ｍＬ），隨即抽真空。本試驗基于常規的固定方法，抽真空前在安瓿瓶內放置了一個適度大小的銅網，使得材料攔于銅網之下，離固定液上層適當距離，而后抽真空。

１．２．２脫水及透明一般的脫水及透明在每級需要時間２～３ ｈ［９］。試驗基于常規的操作步驟，在替換脫水劑后適當地進行抽真空（約１５ ｓ），并根據不同的材料含水情況與結構特點，適當地縮短了每級脫水及透明藥劑的處理時間。具體操作如下，在３０％～５０％的乙醇梯度脫水階段，每級需時０．５ ｈ；從７０％～８５％的乙醇梯度脫水階段，每級１ ｈ；在９５％的乙醇（含１％醇溶性伊紅）中過夜，而后替換３次無水乙醇（每次０．５ ｈ）。透明是按常規的操作方式進行逐級替換的，在加入氯仿后，材料沉底１０ ｍｉｎ再進行下一步的操作。

１．２．３浸蠟及包埋與常規方法不同的是，本試驗是將透明好的材料移入裝有適量氯仿和二甲苯的混合液（v∶v＝９∶１）干燥安瓿瓶中，而后置于恒溫烘箱中，溫度保持在３８～４０ ℃之間；０．５ ｈ后，開始少量多次地向瓶中加入純石蠟屑。浸蠟時間根據材料而定，幼嫩的材料只需１ ｄ，較成熟的組織需要２～３ ｄ。隨后依常規操作進行透蠟和包埋，包埋時蠟液的溫度超過蠟塊的熔點５ ℃。試驗中使用的純蠟熔點為６０～６２ ℃。

１．２．４粘片及展片傳統的粘片與展片是用涂有少量蛋清甘油的載玻片進行粘片，而后在３７ ℃的展片臺上進行展片操作［９］，或者是在溫水浴中進行撈片。不過本試驗有所改動，即先用４５～５０ ℃的去離子水沖洗涂有少許蛋清甘油的載玻片上多余的泡沫與雜質，再滴上適量的４５～５０ ℃的去離子水，而后將適當長度和數量的蠟帶置于水上展片，如蠟帶沒有展好，可在蠟帶附近適量滴加４５～５０ ℃的去離子水以使蠟帶展平。當遇有出現折皺現象的蠟帶時，可反復多次的用５０ ℃去離子水滴在折皺部位的附近至折皺展平。當蠟帶展平后，除去多余的水，置于５５ ℃的恒溫烘箱中烘烤３ ｈ。為了比較不同方法的差異，試驗設置了３種粘片處理，處理１使用蛋清甘油做粘片劑不沖洗；處理２使用蛋清甘油后，用４５～５０ ℃的去離子水沖洗玻片１次后，再粘片；處理３不涂蛋清甘油直接粘片。展片方式設置了２種處理，一是常規展片方式（處理４），將蠟片置于有水的載玻片上，在展片臺上通過加溫來實現展片；二是直接用４５～５０ ℃的去離子水滴加在蠟片上進行展片（處理５）。

１．２．５封片試驗按常規的步驟和方法對烘好的蠟片進行脫蠟、染色和透明。封片劑的類別設置了３種處理，一是加拿大樹膠（處理６）；二是國產中性樹脂（處理７）；三是在使用國產中性樹脂時，適當地添加了少許的二甲苯，組成混合液（處理８）。封好后，在濾紙上吸取多余的封片劑，當場進行拍照觀察，如有需要可在４０ ℃的恒溫烘箱中烘烤２ ｄ，以便于長期保存。

２結果與分析

２．１粘片處理對荷葉鐵線蕨石蠟切片質量的影響

荷葉鐵線蕨石蠟切片制作結果見圖１，不同粘片方式對切片質量的影響結果見表１，從表１可見，涂抹了少量蛋清甘油后，用４５～５０ ℃的去離子水將涂有蛋清甘油的玻片沖洗１次后再粘片，不僅可以除去涂抹過程中產生的蛋清泡沫，還可以除去黏附在上面的雜質，所得到的石蠟切片背景清晰、無雜色、脫片率低，獲得了背景清晰的高質量切片（圖１Ａ、圖１Ｂ）。而常規使用蛋清甘油直接加水的粘片方式，背景不清晰，且有顏色。若不用蛋清甘油，直接粘片，所得到的切片脫片率又相對較高。蛋清甘油因含多聚賴氨酸，相對比作為藥劑出售的多聚賴氨酸價格便宜、易得，常常作為石蠟切片的粘片劑。在使用時，涂抹量要求較少；如果涂抹較多，會在后期處理中發生蛋白質變性，影響染色和制片效果。并且由于涂抹過程中會黏附到很多雜質，導致后期所得制片的背景不純。

２．２展片處理對荷葉鐵線蕨石蠟切片質量的影響

常規展片耗時較長，無法完全地消除蠟帶折皺，而加溫后展片較快，但在撈片過程中易丟失，并且在整張載玻片上不能放置較多的蠟帶。導致蠟片產生折皺的原因很多，如石蠟質地，脫水、浸蠟、包埋、切片時的溫度，切片機性能等。在制片過程中難免會出現這樣或那樣的失誤，從而導致折皺的產生。試驗直接用４５～５０ ℃的去離子水進行展片，針對折皺處滴加４５～５０ ℃的溫水，不僅能加快蠟帶的軟化，使其充分伸展，有效消除和減輕蠟帶的折皺現象，而且又不讓其彌散，保持結構的完整性（圖１Ｃ、圖１Ｄ），還可以在蠟帶展平之后直接去掉多余的水分，節省了展片的時間（表２），所得片子質量與常規的方法沒有差別，并且無需在展片過程中不停地觀察展片情況和蠟帶的位置。試驗中使用的水溫是根據試驗結果篩選而來的，對于不同熔點的石蠟應選擇不同的溫度，一般是選用低于石蠟熔點１０℃的水溫，水溫過高會導致蠟帶彌散，結構不清晰；而過低不能很好地使蠟帶展開。

２．３封片劑對荷葉鐵線蕨石蠟切片質量的影響

不同封片劑對荷葉鐵線蕨石蠟切片質量的影響結果見表３，由表３可見，國產中性樹脂中加入少量二甲苯后，封存的切片厚度適宜，無氣泡，載玻片干凈，切片清晰度高。一般的國產中性樹脂黏稠度較高，封片時難于操作，常出現氣泡［１０］、樹脂過多、封片過厚等現象。在國產中性樹脂中加入了少量的二甲苯用來封片，既可以防止載玻片上的二甲苯風干過快而使樹脂不能均勻分布，形成許多空氣氣泡，同時也能使樹脂黏度適宜，均勻地分布于載玻片和蓋玻片之間，如有多余的樹脂也可用濾紙從載玻片的一側吸去。該方法可以避免在封片操作中由于沒有經驗而易出現的一般問題，是一種對于新手較為適宜的操作方案。

３討論

３．１在固定液中放入銅網后抽真空，材料完整性保持良好

從材料本身來看，荷葉鐵線蕨原葉體結構簡單，含水量高，具有較多的假根；孢子體葉片較薄、革質，氣孔較多；走莖表面具有大量的鱗毛和鱗片。這些結構使得材料內部或表面常常攜帶有較多的氣體，從而導致材料易漂浮于固定液表面。如果瓶內不加銅網，材料漂浮于表面，部分結構直接裸露，在抽真空時壓強變化過快易造成結構破損或變形。而用銅網將材料浸沒于固定液內，不僅可以在抽真空時保持結構的完整，還可以使固定液迅速滲入材料內，從而起到良好的固定效果。

３．２脫水過程中抽真空有利于藥劑滲透

對于一些表面有附屬物結構或內部結構間隙較大的器官，如原葉體、芽或走莖，在每次替換藥劑時，材料會裸露在空氣中，毛隙間又會含有較多的氣體，從而在加入新的藥劑時影響藥劑的滲入。在換完藥劑后，進行短時間抽真空，不僅可以除去附在毛隙間的空氣，還可以通過改變內外壓力，加速藥劑的滲入，縮短處理時間。需要注意的是抽真空的時間不宜過長，過長導致脫水劑中的乙醇濃度下降，影響處理效果。

３．３改良的脫水方式有利于材料脫水完全

石蠟切片中的脫水時間與植物材料的性質和狀態密切相關，常規的脫水流程是由５０％乙醇至１００％乙醇逐級進行的，每級保持在１～３ ｈ，其中１００％乙醇處理重復１～２次［９］。蕨類植物原葉體經常規流程脫水后，材料收縮嚴重，導致材料不平整，難以在后續的切片處理中找準切面。試驗考慮到荷葉鐵線蕨原葉體和愈傷組織具有含水量高、結構簡單、細胞大等特點，調整了脫水劑濃度和脫水時間，從３０％的乙醇開始逐級脫水，并且在脫水過程中不時地搖晃材料，不僅可以加快分子運動，而且也可以使材料與脫水劑充分接觸，使得材料均衡地脫水，有效地降低了材料的收縮程度，維持了結構的飽滿，使原葉體這種細胞形體大、含水量高的材料變形較小，且形態平整，皺縮較少。

３．４少量添加二甲苯，有利于材料的透明與浸蠟

在純氯仿作為透明劑和溶蠟劑的處理中少量地添加二甲苯，有利于材料更好地透明和浸蠟。作為常規透明劑，氯仿作用效果緩和，不易引起材料的嚴重收縮，但其滲透能力不如二甲苯強。對于蕨類相對于木質化的葉柄和走莖而言，僅以氯仿做透明劑和前期的浸蠟劑，作用效果緩慢，需時較長。在常規的處理中，由于材料不同，往往會因透明浸蠟不完全，切片中會出現中心部位材料缺失的現象。但適量地添加二甲苯，不僅能增強透明效果，更可以在后期的浸蠟過程中加大碎蠟的溶解度和滲透性，更好地達到浸蠟效果。

石蠟切片是一項極具實際操作價值和意義的技術手段，運用的范圍極廣。然而要較好地掌握和運用這項技術，不僅要有扎實的理論基礎，還要善于觀察和發現。所以，要提高切片質量，不僅要注意標本材料的自身特性、材料的選取、處理、切片、展片、烘片、脫蠟、染色和封片等每一個環節與步驟的操作規范，還要在現有的條件下根據實際操作需要不斷地摸索與探討，總結經驗以利于完善。

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