溶氧對靈芝液體深層培養產胞外多糖的影響

摘要：以Ｃａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ｘｙ０５為生產菌，采用亞硫酸鹽法測定了搖床上搖瓶不同裝液量下搖床轉速氧容積傳遞系數，比較了不同氧容積傳遞系數對菌絲生長和產胞外多糖的影響，確定氧容積傳遞系數控制在３８～６８ ｈ－１時，發酵效果最佳。在發酵罐上比較了恒定發酵罐攪拌轉速、恒定發酵液ＤＯ值和分段控制發酵液ＤＯ值３種不同控氧方式，結果表明，分段控制發酵液ＤＯ值效果最佳。在最佳的分段控氧模式下菌絲干重達１０．８８ ｇ／Ｌ，胞外多糖達２．８８ ｇ／Ｌ。

關鍵詞：溶氧；靈芝；發酵；胞外多糖

中圖分類號：Ｓ５６７．３＋１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3804-03

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ Ｏｘｙｇｅｎ ｏｎ Ｅｘｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ Ｐｒｏｄｕｃed ｂｙ Ｄｅｅｐ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ lｕｃｉｄｕｍ

ＺＨＯＵ Ｘｉａｏ－ｐｉｎｇ，ＹＡＮＧ Ｈａｉ－ｊｕｎ

（Ｘｉｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒe Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｘｉｎｙａｎｇ ４６４０００， Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ｘｙ０５ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅs． Ｔｈｅ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｋＬａ ｏｆ ｆｌａｓｋ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｏｌｕｍｅ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｔａｔｅ ｓｐｅｅｄ ｏｆ sｈａｋｅｒ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｕｌｐｈｉｔｅ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｋＬａ ｖａｌｕｅ ｏｎ the growth and fermentation of Ｃ. ｌｕｃｉｄｕｍ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗed ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｋＬａ ｖａｌｕｅ waｓ ３８～６８ ｈ-1． Ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｏｘｙｇｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ， ｆｉｘｅｄ ｒｏｔａｔｅ ｓｐｅｅｄ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ， ｆｉｘｅｄ ＤＯ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＤＯ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ， ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗed ｔｈｅ ｓｕｂｓｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｘｙｇｅｎ ｍｏｄｅ waｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ． Iｎ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｈｙｐｈａ waｓ １０．８８ｇ／Ｌ，ｔｈｅ ｅｘｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｒｅａｃｈed ２．８８ ｇ／Ｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ oｘｙｇｅｎ； Ｃａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ； ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｅｘｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ

靈芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ），為擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，是一種重要的藥用真菌。現代醫學證明其具有防止動脈硬化，提高機體免疫力，抗腫瘤，抗衰老等［１］。靈芝多糖是靈芝中最有效的成分之一，受到廣泛的關注［２］。傳統上，靈芝采用固體培養，收獲其子實體。但靈芝子實體形成周期長，所需勞動強度大。現代工業主要通過液體深層培養收獲其菌絲和發酵液，從中提取靈芝多糖。靈芝屬于好氧真菌，在深層培養要獲得最大的菌絲生物量和靈芝多糖產量，必須供給適量的氧氣。在靈芝的搖瓶液體深層培養研究中，溶氧主要通過改變搖瓶裝液量和搖床轉速來調節［３，４］。試驗研究了搖瓶轉速和裝液量與氧容積傳遞系數的關系，確定了搖瓶液體深層培養的最佳氧容積傳遞系數范圍；進一步在發酵罐上研究了不同控氧模式對靈芝液體深層培養產胞外多糖的影響，確定最佳的分段控氧模式，以供相關研究和生產參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１菌種靈芝Ｃａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ｘｙ０５，信陽農業高等專科學校生物技術實驗室保存。

１．１．２菌種培養基①斜面保藏培養基：葡萄糖０．１％，蛋白胨１％，酵母膏１％，ＮａＣｌ ０．２５％，瓊脂２％，ｐＨ為５．５，０．１ ＭＰａ ２０ ｍｉｎ滅菌；②活化斜面培養基：葡萄糖０．２％，蛋白胨１％，酵母膏１％，ＮａＣｌ ０．２５％，瓊脂２％，ｐＨ為５．５，０．１ ＭＰａ ２０ ｍｉｎ滅菌；③種子培養基：葡萄糖２％、酵母粉０．２％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．１％，ｐＨ為５．５，０．１ ＭＰａ ２０ ｍｉｎ滅菌；④發酵培養基：葡萄糖５％，蛋白胨１％，牛肉膏１％，ｐＨ為５．５，０．１ ＭＰａ ２０ ｍｉｎ滅菌。

１．１．３主要儀器超凈工作臺（ＳＷ－ＣＪ－２Ｆ），蘇州凈化儀器廠；生化培養箱（ＬＲＨ－２５０Ａ），廣東醫療器械廠；電熱鼓風干燥箱（ＤＬ１０２），天津市試驗儀器廠；電子分析天平（ＦＡ２００４），上海良平儀器儀表有限公司；臺式高速離心機（Ｈ－１６５０），湖南湘儀實驗室儀器；立式雙層恒溫搖床（ＨＮＹ－２１０２Ｃ），鄭州南北儀器設備有限公司；１０Ｌ在位滅菌自動臺式發酵罐（ＳＹ－３０１０Ｂ），上海世遠生物設備工程有限公司。

１．２培養方法

１．２．１菌種活化從斜面保藏培養基切出蠶豆大小的菌絲接種于活化斜面培養基中，２５ ℃培養５ ｄ。

１．２．２種子培養將活化的靈芝斜面菌種切割成１ ｃｍ２大小的斜面菌絲塊，接種２～３塊于裝有５０ ｍＬ種子培養基的５００ ｍＬ三角瓶中，置于搖床２８ ℃恒溫１４０ ｒ／ｍｉｎ 振蕩培養５ ｄ。

１．２．３搖瓶培養按１０％的接種量，ｐＨ為５．５，恒溫２８ ℃振蕩培養７ ｄ。

１．２．４發酵罐培養１０ Ｌ發酵罐裝發酵培養基６ Ｌ，接種量１０％，通風量２００ Ｌ／ｈ，罐壓０．０５ ＭＰａ，ｐＨ為５．５，發酵７ ｄ。

１．３分析方法

１．３．１菌絲體干重測定取５０ ｍＬ發酵液，３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，經無菌水洗滌多次后，將菌絲體在１０５ ℃烘干至恒重，得菌絲體干重。

１．３．２發酵液中胞外粗多糖含量的測定發酵液

３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，取上清液在６０℃水浴鍋中濃縮，濃縮液中加入等體積８５％的酒精沉淀，放置于冰箱中過夜。然后將濃縮液３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，將離心的沉淀物放在烘箱中６０℃烘干，稱重。

１．３．３溶氧系數的測定采用亞硫酸鹽氧化法［５］。

２結果與分析

２．１靈芝液體搖瓶培養供氧的控制

在靈芝的液體深層培養中，氧的氣液傳質方程式為［６］：

ＯＴＲ＝ｋＬａ（Ｃ*－ＣＬ）

式中，ＯＴＲ為單位體積培養液的氧傳遞速率，單位為ｍｏｌ／ｍ３·ｓ；Ｃ*為在供氧空氣中氧分壓下發酵液中氧的飽和濃度；ＣＬ為發酵液中實際的氧濃度；ｋＬａ為氧容積傳遞系數。

靈芝菌絲體對氧的需要速率，即為了避免氧成為限制因素必須滿足的供應速率為：

ＣｃＱｏ２＝ｋＬａ（Ｃ*－ＣＬ）

式中，Ｃｃ為菌體細胞的濃度，單位為ｇ／Ｌ；Ｑｏ２為微生物的呼吸強度，單位為ｍｏｌ／ｋｇ·ｓ。

在搖瓶發酵中供氧空氣為常壓，所以Ｃ*為固定值。微生物若處于充裕的通氣下，ＣＬ會逐漸接近Ｃ*，反之ＣＬ會逐漸下降趨于０。為了保證培養液中有適當的氧濃度ＣＬ，需要控制適當的ｋＬａ值，搖瓶裝液量和搖床轉速的改變都會使ｋＬａ改變。不同裝液量下搖床轉速對靈芝發酵的影響及ｋＬａ值分別見圖１、圖２和圖３。比較圖１和圖２，可知靈芝在搖瓶液體深層培養時，靈芝的生長和胞外多糖的生產是一致的，靈芝的生物量越大，生成的胞外多糖產量也就越高。搖瓶的裝液量越大，要獲得較高的靈芝生物量和胞外多糖產量，搖床轉速相對就要提高。但搖床轉速過高時，靈芝的生物量和胞外多糖產量反而會下降。再對照圖３可知，不同的搖瓶裝液量下，靈芝的生物量和胞外多糖產量最高的搖床轉速集中在ｋＬａ為３８～６８ ｈ－１的區域。由此可知，靈芝在進行搖瓶液體深層培養時，將ｋＬａ控制在３８～６８ ｈ－１為最佳，搖瓶裝液量增大時，可相應提高搖床轉速增加ｋＬａ以達到最佳的發酵效果。

２．２發酵罐溶氧控制

２．２．１調節發酵罐攪拌轉速控制溶氧在攪拌式發酵罐中，通風量過大時會使罐壓提高，由于氧分壓過高會造成微生物暫時的中毒而影響菌體的生理代謝，所以調節空氣流量控制發酵液中溶氧效果并不佳。因此，發酵全過程通風量固定為２００ Ｌ／ｈ，罐壓控制在０．０５ ＭＰａ，通過調節攪拌轉速控制發酵液中的溶氧含量。在上述條件，不同攪拌速度下ｋＬａ值如圖４所示，不同轉速下靈芝培養結果見圖５。從圖４和圖５中可以看出ｋＬａ值隨著攪拌轉速的提高而迅速增加。攪拌轉速在１５０～２５０ ｒ／ｍｉｎ時（ｋＬａ為３８～７０ ｈ－１）發酵效果最佳，菌絲體干重及胞外多糖的產量最大。該結果和搖瓶上的數據基本一致。

２．２．２通過控制ＤＯ值來控制溶氧在上述通過固定轉速來控制溶氧的發酵過程中，在發酵初期菌絲體的生物量Ｃｃ較小，ＣｃＱｏ２值也較小，根據式ＣｃＱｏ２＝ｋＬａ（Ｃ*－ＣＬ），發酵初期發酵液中溶氧濃度ＣＬ會接近在供氧空氣中氧分壓下發酵液中氧的飽和濃度Ｃ*。但伴隨著培養時間的延長，Ｃｃ增大，發酵液中溶氧濃度ＣＬ會逐漸下降。要控制發酵液中的實際溶氧濃度ＣＬ長期維持在一個最優的水平，則需要隨著菌絲增長及呼吸量改變而調節攪拌轉速。在自動發酵罐中可通過設定轉速和ＤＯ值（ＣＬ／Ｃ*）的關聯自動控制轉速，使ＤＯ值維持在穩定的水平。不同ＤＯ值下靈芝發酵結果如圖６所示。從圖６可知，控制ＤＯ值維持在２０％時最佳，菌絲干重和胞外多糖產量都比恒定發酵罐轉速時的最高產量要高，說明恒定ＤＯ值比恒定發酵罐轉速的控氧效果好。

２．２．３分階段供氧研究考慮到靈芝菌絲處于生長的不同階段對氧的需求是不一樣的，發酵液中最佳的溶氧濃度ＣＬ也應不同。因此考慮分段控制發酵罐ＤＯ值。將靈芝培養分為３段，采用表１所示Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ ４種不同的控氧方式發酵，結果如圖７所示。由圖７可以看出，分階段供氧控制模式中Ｂ、Ｄ兩種控氧模式都優于恒定ＤＯ值控氧模式（Ｃ）。其中分階段供氧控制模式Ｂ效果最佳，菌絲干重達１０．８８ ｇ／Ｌ，胞外多糖達２．８８ ｇ／Ｌ。

３小結

靈芝液體深層培養屬于好氧發酵，必須控制培養液中適宜的溶氧濃度，過高或過低的溶氧濃度對靈芝菌絲體的生長和胞外多糖的合成都是不利的。

采用亞硫酸法測定的氧容積傳遞系數可作為靈芝液體深層培養控氧的依據。在固定搖床轉速或發酵罐攪拌轉速發酵時控制氧容積傳遞系數在３８～６８ ｈ－１時發酵效果最佳。

在發酵罐上分段控氧模式比單純固定攪拌轉速或固定ＤＯ值控氧模式更有利于靈芝的生長和胞外多糖的生產。在０～５６ ｈ ＤＯ值為３０％，５６～１１２ ｈ為２０％，１１２～１６８ ｈ為１０％的控氧模式下發酵效果最佳，菌絲干重達１０．８８ ｇ／Ｌ，胞外多糖達２．８８ ｇ／Ｌ。

參考文獻：

［１］ 陳志杰，顧振新．靈芝主要活性物質及液體深層發酵技術研究進展［Ｊ］．食品研究與開發，２００８，２９（３），１８６－１９０．

［２］ 楊占濤，劉超，李月，等．靈芝多糖的研究現狀［Ｊ］．安徽農業科學，２００８，３６（２０）：８６５１－８６５２，８７３９．

［３］ 鉏曉艷，張日俊．靈芝真菌的液體深層發酵技術［Ｊ］．飼料工業，２００５，２６（８）：２１－２３．

［４］ 衛軍，黃鶴，劉風珠，等． 靈芝液體發酵條件研究及保健飲料的研制［Ｊ］．食用菌，２００７（１）：６１－６３．

［５］ 宋超先．微生物與發酵基礎教程［Ｍ］．天津：天津大學出版社，２００７．３２２－３２３．

［６］ 曹軍衛，馬輝文，張甲耀，等．微生物工程［Ｍ］．北京：科學出版社，２００７．