暗紫貝母內(nèi)生真菌紅色素的提取及穩(wěn)定性研究

摘要：探索一種暗紫貝母內(nèi)生真菌所產(chǎn)紅色素的提取工藝，并研究酸堿度、溫度、光照、紫外線、碳水化合物添加劑、氧化劑H2O2、還原劑Na2SO3、金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響。結(jié)果證明，當采用超聲波法破碎細胞，以丙酮作為溶劑時，提取效果最好。該紅色素的最大吸收峰在２１０ ｎｍ，金屬離子Ｓｎ２＋、Ｐｂ２＋可以使紅色素產(chǎn)生絡(luò)合物，在自然光照下紅色素易退色。該紅色素可能是一種性能較好的天然色素，具有較高的開發(fā)利用價值。

關(guān)鍵詞：暗紫貝母；內(nèi)生真菌；紅色素；提取；穩(wěn)定性

中圖分類號：Ｓ５６７．２３＋１文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3815-03

Study on the Extraction and Stability of Red Pigments from An Endophytic Fungi of Fritillaria unibiacteata

ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ－ｄｏｎｇ，ＺＥＮＧ Ｘｕｅ－ｌｉ，ＣＨＥＮ Ｑｕｅ，ＷＵ Ｗｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｓｉｃｈｕａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａ＇ａｎ ６２５０１４，Ｓｉｃｈｕａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ａｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｏｆ Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｕｎｉｂｉａｃｔｅａｔａ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ， ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｒａｄｉａｔｉｏｎ， ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ， ｏｘｉｄａｎｔ of H2O2， ｒｅｄｕｃｔａｎｔ of Na2SO3， ａｎｄ ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｇｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｆ ｅｘｔｒａｃｔed ｂｙ ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ ｕｓｉｎｇ ａｃｅｔｏｎｅ ａｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅａｋ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｇｍｅｎｔ ｗａｓ ａｔ ２１０ ｎｍ．Ｔｈｅ ｐｉｇｍｅｎｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｂｙ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓ of Ｓｎ２＋ ａｎｄ Ｐｂ２＋， ａｎｄ ｗｏｕｌｄ ｄｅｐｉｇｍｅｎｔ ｕｎｄｅｒ ｎａｔｕｒａｌ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｉｔ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｖａｌｕａｂｌｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｕｓｅ ａｓ ａ ｎａｔｕｒａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｆｒｉｔｉｌｌａｒｉａ ｕｎｉｂｉａｃｔｅａｔａ； ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ； ｒｅｄ ｐｉｇｍｅｎｔ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｓｔａｂｉｌｉｔｙ

多年來，色素因其感官的絢麗多彩而被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品和紡織品領(lǐng)域。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認識到有些以苯胺類為主的合成色素會在人體內(nèi)形成致癌物（β－萘胺，ｄ－氨基萘胺），這使其在食品工業(yè)中的應(yīng)用日益受到限制。因此，天然色素的開發(fā)已經(jīng)勢在必行［１］。天然色素可從動植物中提取，但存在成本高、價格貴、工藝復雜及著色力差等不足之處。天然色素廣泛存在于各種生物體內(nèi)，按其來源可分為動物色素、植物色素、微生物色素和礦物色素等，在自然界中，產(chǎn)色素的微生物種類很多［２］。利用微生物生產(chǎn)色素，不受資源、環(huán)境和空間的限制，并可通過微生物大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)色素，既可降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，又可避免因原料緊缺造成的環(huán)境破壞，保護生態(tài)環(huán)境，實現(xiàn)人與自然的和諧發(fā)展［３－８］。

與其他色素相比，天然紅色素資源更缺乏，國內(nèi)經(jīng)常使用的兩種有爭議的食品合成色素莧菜紅和胭脂紅至今未能完全被替代。試驗以一株川貝母暗紫貝母的內(nèi)生真菌為出發(fā)菌，經(jīng)超聲波提取得到一種天然紅色素，并對該色素穩(wěn)定性進行了研究。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１內(nèi)生真菌菌株從暗紫貝母（采自恩威公司新都橋川貝母人工種植基地）鱗莖中分離得到。

１．１．２培養(yǎng)基平板和斜面培養(yǎng)基采用ＰＤＡ培養(yǎng)基：馬鈴薯２００．０ ｇ，葡萄糖２０．０ ｇ，瓊脂粉１５．０ ｇ，自來水１ ０００ ｍＬ，調(diào)ｐＨ為６～７，１２１ ℃、３０ ｍｉｎ高壓蒸汽滅菌；發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯２００．０ ｇ，葡萄糖４０．０ ｇ，自來水１ ０００ ｍＬ，調(diào)ｐＨ為６～７，１２１ ℃、３０ ｍｉｎ高壓蒸汽滅菌。

１．1.3主要儀器ｐＨ酸度計，電子天平，日本島津ＵＶ２４５０型紫外分光光度計，恒溫搖床，全自動高壓滅菌鍋，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等。

１．2方法

１．2．１紅色素的生產(chǎn)和提取工藝菌種→擴培→發(fā)酵→收集菌體→超聲波提取→減壓濃縮→紅色素粗品。

１．2．２菌體培養(yǎng)從保存試管培養(yǎng)基斜面上挑取單菌落接種于ＰＤＡ培養(yǎng)基中，２８ ℃，恒溫培養(yǎng)３ ｄ，將菌絲轉(zhuǎn)接于裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶中（１５０ ｍＬ／２５０ ｍＬ），總計２０瓶，放于２６℃、１１０ ｒ／ｍｉｎ恒溫搖床培養(yǎng)７ ｄ，抽濾，棄上清液，得紅色菌體。

１．2．３不同溶劑下紅色素的提取方法稱濕菌體６份，每份２．０ ｇ，分別加入去離子水、甲醇、乙醇、甲醇和丙酮的混合液（１∶１，Ｖ∶Ｖ，下同）、丙酮、乙酸乙酯４０ ｍＬ，在超聲功率400 W、超聲10 S間歇20 S條件下超聲破碎30 min，過濾除去菌體，即為紅色素在不同溶劑中的提取液。

２結(jié)果與分析

２．１紅色素的吸收光譜

稱取濕菌體２．０ ｇ，２０ ｍＬ丙酮作溶劑，超聲波法提取紅色素，抽濾得紅色素溶液，在２５ ℃下用日本島津ＵＶ２４５０型紫外分光光度計于１９０ ｎｍ到５００ ｎｍ范圍內(nèi)掃描測定，測定結(jié)果見圖１。由圖可知，紅色素在２１０ ｎｍ處有一個最大吸收峰，該峰為紅色素的特征吸收峰。

２．２不同溶劑對紅色素提取量的影響

根據(jù)1.2.3所述方法獲得的不同溶劑的紅色素提取液，分別在２１０ ｎｍ處用紫外分光光度計測定吸光度（ＯＤ）值。紅色素在２１０ ｎｍ處的ＯＤ值與紅色素含量呈正比，ＯＤ值越大，單位體積中紅色素的含量越高，即溶解度越大，提取量越高。結(jié)果見表１。從表１可見，紅色素在不同溶劑中測得的ＯＤ值不同，即溶解度不同。在室溫條件下，紅色素在丙酮中的ＯＤ值最大，溶解度最大，提取量最大。

２．３紅色素的穩(wěn)定性分析

２．３．１酸堿度對紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素提取液１２等分，以ＮａＯＨ和ＨＣｌ溶液調(diào)ｐＨ，在室溫下用ｐＨ酸度計調(diào)節(jié)各溶液的ｐＨ分別為１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２，室溫（２５ ℃）下避光放置０．５ ｈ后，在２１０ ｎｍ下測定ＯＤ值，結(jié)果見表２。由表２可知，當ｐＨ＜７時，隨著ｐＨ降低，紅色素溶液ＯＤ值減少，顏色呈淺黃色，ｐＨ≥７時，紅色素溶液ＯＤ值變化不大，顏色呈紅色，說明紅色素在堿性環(huán)境中較穩(wěn)定。

２．３．２溫度對紅色素穩(wěn)定性的影響取ｐＨ為９的紅色素溶液，分別在２５、４０、６０、８０、１００ ℃恒溫水浴中放置０．０、０．５、１．０、１．５ ｈ，冷卻至室溫后定容至相同體積，在２１０ ｎｍ處測定ＯＤ值，結(jié)果見表３。由表３可知，ｐＨ為９時，紅色素溶液在２５ ℃到１００ ℃范圍內(nèi)，隨溫度的升高，其ＯＤ值有先增大后減小的趨勢，但顏色變化不明顯，可能是紅色素中某化合物的吸光基團因溫度的升高構(gòu)象有所改變導致的。說明該化合物的熱穩(wěn)定性較好。

２．３．３光照對紅色素穩(wěn)定性的影響將ｐＨ為９的紅色素溶液分別置于光照和黑暗環(huán)境下，間隔一定時間測定各溶液ＯＤ值，結(jié)果見表４。由表４和試驗觀察可知，光照條件下，紅色素溶液的ＯＤ值隨著時間的延長逐漸變小，從第３天開始，顏色逐漸變淡，直至第６天，近于無色，而放于黑暗條件下的溶液，ＯＤ值基本保持不變，而且顏色也無明顯變化，說明紅色素對光照不穩(wěn)定?？赡苁枪庹蘸蜏囟鹊耐瑫r作用，使得紅色素的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，減少了其溶液的ＯＤ值。

２．３．４紫外光對紅色素穩(wěn)定性的影響在波長２1０ ｎｍ的紫外燈下照射ｐＨ為９的紅色素溶液，分別在照射了０、２０、４０、６０、８０、１００ ｍｉｎ時測定ＯＤ值，結(jié)果見表５。由表５可知，在紫外光的照射下，紅色素溶液在２１０ｎｍ處的ＯＤ值只在一個較小的范圍內(nèi)波動，說明紫外光對紅色素的吸光基團影響不大，對紅色素的穩(wěn)定性影響不大。

２．３．５碳水化合物添加劑對紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素溶液，分別配制含蔗糖、葡萄糖濃度為３０ ｇ／Ｌ的紅色素溶液，在室溫（２５ ℃）下避光放置０．５ ｈ后，在２１０ ｎｍ下測定ＯＤ值，結(jié)果見表６。由表６可知，不加任何碳水化合物添加劑的紅色素溶液（對照）的最大ＯＤ值為１．４８６，而加了碳水化合物添加劑的紅色素溶液在放置４ ｄ后，ＯＤ值及溶液顏色變化不大，沒有沉淀產(chǎn)生，說明葡萄糖和蔗糖對紅色素的穩(wěn)定性沒有影響。

２．３．６氧化劑Ｈ２Ｏ２對紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素溶液，配制Ｈ２Ｏ２濃度為０．００％、０．０３％、０．３０％、１．５０％、３．００％（Ｖ／Ｖ，下同）的紅色素溶液，在室溫（２５ ℃）下避光放置０．５ ｈ后，在２１０ ｎｍ處測定ＯＤ值，結(jié)果見表７。由表７可知，未添加Ｈ２Ｏ２的紅色素溶液的ＯＤ值比含有Ｈ２Ｏ２的紅色素溶液的ＯＤ值大很多，且隨著Ｈ２Ｏ２濃度的增大，最大ＯＤ值逐漸減小，顏色明顯變淺。說明該紅色素耐氧化性較差，易因氧化而退色，應(yīng)用時應(yīng)避免強氧化劑的加入。

２．３．７還原劑Ｎａ２ＳＯ３對紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素溶液，配制Ｎａ２ＳＯ３濃度為０、２×１０－４、５×１０－４、１×１０－３、３×１０－３、５×１０－３ｍｏｌ／Ｌ的紅色素溶液，在室溫（２５ ℃）下避光放置０、１、２、３、４ ｄ后，在２１０ ｎｍ處測定ＯＤ值，結(jié)果見表８。由表８可知，該紅色素隨還原劑Ｎａ２ＳＯ３濃度的增大，放置時間的增長，顏色變淺，在前３ ｄ ＯＤ值減小，第４天又稍有增大，說明該色素的耐還原性較差，第４天由于Ｎａ２ＳＯ３被空氣氧化，還原性減弱，紅色素溶液的ＯＤ值又有所增大。

２．３．８金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響取紅色素溶液，配制含不同金屬離子Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋、Ａｌ３＋、Ｐｂ２＋、Ｓｎ２＋，濃度均為１×１０－４ ｍｏｌ／Ｌ的紅色素溶液，在室溫（２５℃）下避光放置不同的時間０、２４ ｈ后，在２１０ ｎｍ處測定ＯＤ值，結(jié)果見表９。從表９可知，２４ ｈ后含Ｃｏ２＋的紅色素溶液的ＯＤ值減小，Ｐｂ２＋、Ｓｎ２＋與紅色素發(fā)生絡(luò)合，產(chǎn)生絮狀沉淀。Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ａｌ３＋對紅色素的穩(wěn)定性影響不大。

３結(jié)語

從暗紫貝母內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中得到的紅色素，在紫外光譜下測其最高吸收峰在２１０ ｎｍ，其微溶于水，易溶于有機溶劑，在丙酮中溶解性最好，提取量最高。在堿性溶液中比在酸性溶液中穩(wěn)定性好，ｐＨ為８～１０穩(wěn)定好；在ｐＨ值為９時，該紅色素的熱穩(wěn)定性較好；光照及部分金屬離子Ｃｏ２＋、Ｐｂ２＋、Ｓｎ２＋對該紅色素穩(wěn)定性影響較大，紫外光對該紅色素穩(wěn)定性幾乎不影響；但該紅色素的耐氧化性、耐還原性較差。本研究成果作為一種天然色素的暗紫貝母內(nèi)生真菌產(chǎn)生的紅色素的實際應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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