產堿性纖維素酶芽孢桿菌ZA-05的分離及功能基因克隆

摘要：從造紙污泥中分離到一株芽孢桿菌ＺＡ－０５，該菌可產生內切β－１，４-葡聚糖酶酶活性，且在堿性條件下酶活較高，經生理生化和分子生物學鑒定，該菌株為淀粉液化芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）；根據ＧｅｎＢａｎｋ登錄的內切-β－１，４-葡聚糖酶基因（ＤＱ７８２９５４．１，Ｍ２８３３２．１，ＡＹ８５９４９２．１）的同源性序列，利用ＰＣＲ方法克隆到該菌株的功能基因，并對其進行測序。測序結果顯示其全長為１ ５００ ｂｐ，推測其含４９９個氨基酸。

關鍵詞：淀粉液化芽孢桿菌；分離鑒定；堿性纖維素酶；基因克隆

中圖分類號：Ｑ９３９．１２４文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3859-04

Isolation and Functional Gene Cloning of Alkaline Glucanase Producing Bacillus

Strain ZA-05

ＷＥＩ Ｙａｎ－ｌｉ，ＬＩ Ｈｏｎｇ－ｍｅｉ，ＬＩ Ｊｉ－ｓｈｕｎ，ＨＵ Ｊｉｎ－ｄｏｎｇ，ＹＡＮＧ Ｈｅ－ｔｏｎｇ

（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｊｉｎａｎ ２５００１４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａｎ ａｌｋａｌｉｎｅ ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ＺＡ－０５ which had the enzyme activity of ｅｎｄｏ－β－１， ４－ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐａｐｅｒ ｍｉｌｌ ｓｌｕｄｇｅ ｂｙ Ｃｏｎｇｏ－ｒｅｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ． Ｉｔ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｔｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ａｎｄ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏ－β－１， ４－ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ． ＤＱ７８２９５４．１， Ｍ２８３３２．１， ＡＹ８５９４９２．１）， ａｎ ａｌｋａｌｉ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ． Ｔｈｅｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｉｓ ａｌｋａｌｉ－ｔｏｌｅｒａｎｔ ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ １ ５００ ｂｐ ａｎｄ ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ４９９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ； ａｌｋａｌｉｎｅ ｇｌｕｃａｎａｓｅ； ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ

纖維素酶是能將纖維素水解成還原糖的一類酶系的總稱，主要包括內切-β－１，４－葡聚糖酶（ｅｎｄｏ－１，４－β－Ｄ－ｇｌｕｃａｎａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．４，ＥＧ）、纖維二糖水解酶（ｅｘｏ－１，４－β－Ｄ－ｇｌｕｃａｎａｓｅ，ＥＣ ３．２．１．９１，ＣＢＨ）和β－葡萄糖苷酶（β－１，４－ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，ＥＣ３．２．１．２１，ＢＧ）；按適宜ｐＨ值不同，又可分為酸性纖維素酶（最適ｐＨ為４．５～５．５）、中性纖維素酶（最適ｐＨ為６．０～８．０）和堿性纖維素酶（最適ｐＨ為８．０～１１．０）。

堿性纖維素酶主要由在堿性環境中生長的芽孢桿菌和鏈霉菌產生。其最適ｐＨ處于堿性范圍，具有水解細小織物纖維的能力，可以作為洗滌用酶。堿性纖維素酶加入到洗滌劑中不僅可以增強洗滌效果，而且對衣物還具有柔軟、增艷的作用，其發現和應用被稱為洗滌劑工業的一次技術革命［１］。可生產堿性纖維素酶的微生物種類很多，但用于工業化生產的主要是芽孢桿菌的幾個種，如地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和嗜堿性芽孢桿菌等。

該研究從造紙污泥中分離到一株產堿性纖維素酶的淀粉液化芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ），并對其功能基因進行了克隆。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１主要試劑ＰＣＲ試劑、限制性內切酶、氨芐青霉素（Ａｍｐ）、核酸分子量標準物、ＤＮＡ凝膠回收試劑盒、Ｔ４ ＤＮＡ連接酶和Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ、測序載體ｐＭＤ１８－Ｔ等分別購自上海生工生物工程技術服務有限公司和寶生物工程（大連）有限公司等公司。

１．１．２主要培養基羧甲基纖維素培養基：羧甲基纖維素１ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ０．１８７ ｇ，檸檬酸０．１２５ ｇ，瓊脂１ ｇ；其他生理生化鑒定培養基配方參照文獻［２］。

１．２方法

１．２．１樣品采集污泥土樣（ｐＨ 為９．５～１０．５）采自山東威海某造紙廠污水排放口處。

１．２．２菌株分離取１ ｇ土樣放入裝有９ ｍＬ無菌水的試管中，混勻后于８０ ℃水浴加熱２０ ｍｉｎ，取１ ｍＬ進行梯度稀釋，分別取稀釋到１０－４、１０－５、１０－６的稀釋液涂布ＮＡ培養基平板，３０ ℃培養２４ ｈ。挑取不同形態的單菌落轉接至ＮＡ培養基斜面上，３０ ℃恒溫培養２４ ｈ，置于４ ℃冰箱保存備用。

１．２．３菌株活性檢測內切-β-1，4-葡聚糖酶酶活性的測定參考文獻［３］，將純化后的菌株點接在羧甲基纖維素培養基平板上，３０ ℃培養約３０ ｈ后，用１ ｍｇ／ｍＬ的剛果紅溶液染色２０ ｍｉｎ，倒去染色液并用１ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液沖洗，去掉表面附著的剛果紅，觀察是否出現透明水解圈。

１．２．４初始ｐＨ對菌株內切-β-1，4-葡聚糖酶酶活性的影響配制ｐＨ分別為４、５、６、７、８、９、１０、１１的羧甲基纖維素培養基，點接純化后的菌株，３０ ℃培養３０ ｈ，用１ ｍｇ／ｍＬ的剛果紅溶液染色２０ ｍｉｎ，倒去染色液并用１ ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ溶液脫色，測量菌落的透明圈直徑，作為纖維素酶的相對活性。

１．２．５菌株的生理生化鑒定生理生化試驗的選擇主要根據《常見細菌系統鑒定手冊》中相應屬、種鑒定有關的內容進行。共選取了Ｖ．Ｐ．試驗、硝酸鹽還原、吲哚試驗、淀粉水解、過氧化氫酶、糖發酵、檸檬酸鹽、甲基紅、苯丙氨酸脫氨酶、纖維素分解、脲酶、丙二酸鹽、明膠液化、精氨酸脫羧酶、耐鹽試驗等試驗，具體方法參照文獻［２］。

１．２．６菌株的分子鑒定細菌基因組ＤＮＡ的提取與純化參照文獻［４］。以菌株的基因組ＤＮＡ為模板，１６Ｓ ｒＤＮＡ通用引物Ａ（５′－ＧＡＧ ＴＴＴ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＧＣ ＴＣＡ Ｇ－３′）和Ｂ（５′－ＴＡＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＴ ＧＴＴ ＡＣＧ－３′）進行擴增。擴增條件：９４℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，５１ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸２ ｍｉｎ，３０個循環；最后７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ產物由上海生工生物技術有限公司測序，利用ＢＬＡＳＴ軟件將１６Ｓ ｒＤＮＡ序列與ＧｅｎＢａｎｋ中已測定的原核生物１６Ｓ ｒＤＮＡ序列進行比較，構建系統進化樹。

１．２．７內切-β－１，４葡聚糖酶編碼基因的克隆根據ＧｅｎＢａｎｋ登錄的內切-β－１，４葡聚糖酶基因（ＤＱ７８２９５４．１，Ｍ２８３３２．１，ＡＹ８５９４９２．１），設計內切-β－１，４葡聚糖酶基因ＯＲＦ的ＰＣＲ引物：ｅｇｌＦ（５′－ ＡＴＧ ＡＡＡ ＣＧＧ ＴＣＡ ＡＴＣ ＴＣＴ Ａ－３′）和ｅｇｌＲ（５′－ ＣＴＡ ＡＴＴ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＧＴ ＴＣＣ ＣＣＡ－３′），以菌株ＺＡ－０５基因組ＤＮＡ為模板進行ＰＣＲ擴增。ＰＣＲ反應程序為９５ ℃預變性５ ｍｉｎ；９４ ℃變性４０ ｓ，５３ ℃退火５０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ ３０ ｓ，３０個循環；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。

１．２．８內切-β－１，４葡聚糖酶基因序列測定和分析將ＰＣＲ產物純化后與ｐＭＤ１８－Ｔ載體連接，轉化Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α感受態細胞，采用藍白斑篩選法篩選轉化子，搖瓶菌培養后提質粒酶切鑒定，選取陽性轉化子送上海生工生物技術有限公司進行測序。測序結果用ＤＮＡＭＡＮ軟件分析，將所得序列通過ＮＣＢＩ的ＢＬＡＳＴ進行序列相似性分析。

２結果與分析

２．１菌株分離及活性鑒定

稱取１ ｇ造紙廠堿性污泥樣品，用無菌水梯度稀釋后，涂布于ＮＡ培養基平板上，培養后共獲得９株不同形態的單菌落，點接在羧甲基纖維素培養基平板上，３７℃培養后，用剛果紅溶液染色，獲得１株透明圈較大的菌株ＺＡ－０５，如圖１。透明圈的大小在一定程度上反應了菌株產酶能力的強弱。

２．２ｐＨ對菌株內切β-1，4-葡聚糖酶酶活性的影響

菌株ＺＡ－０５在不同ｐＨ羧甲基纖維素培養基平板上表現的水解圈的大小也不同。其在ｐＨ為４和５的羧甲基纖維素培養基平板上幾乎不能生長，沒有表現出任何酶解活性；隨著ｐＨ的升高，ＺＡ－０５的活性也隨著升高，當ｐＨ為１０時活性最大，水解圈直徑達到２．３７ ｃｍ。

２．３菌株ＺＡ－０５的鑒定

２．３．１菌株ＺＡ－０５的生理生化鑒定菌體呈短桿狀，染色均勻，具運動性，兼性厭氧，可形成內生芽孢，芽孢囊膨大，呈橢圓形，游離芽孢表面著色弱。在ＬＢ培養基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落邊緣不規則。生理生化試驗結果見表１。從表１中可知，菌株ＺＡ－０５接觸酶、硝酸鹽還原、淀粉水解、Ｄ－葡萄糖發酵、明膠水解和酪素水解等為陽性；吲哚產生試驗、Ｖ．Ｐ．試驗、甲基紅試驗、卵磷脂酶、Ｈ２Ｓ產氣試驗等為陰性，與淀粉液化芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）一致。

２．３．２菌株ＺＡ－０５的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析鑒定利用通用引物從ＺＡ－０５基因組中擴增出約１ ５００ ｂｐ的片段，序列測定后與ＧｅｎＢａｎｋ中的序列進行比對，將相似性較高的１０個菌株構建系統進化樹，結果如圖３所示。菌株ＺＡ－０５的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列與芽孢桿菌屬的淀粉液化芽孢桿菌［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＥＵ３７３３８７）］相似性為９９．２６％，與枯草芽孢桿菌［Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＡＢ５０１１１３）］相似性為９９．３４％。結合菌株ＺＡ－０５的生理生化特性和１６Ｓ ｒＤＮＡ序列相似性，對照《常見細菌系統鑒定手冊》，鑒定菌株ＺＡ－０５屬于淀粉液化芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）。

２．４內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼基因的克隆

以菌株ＺＡ－０５基因組為模板，利用引物ｅｇｌＦ／ｅｇｌＲ進行ＰＣＲ擴增（圖４）。結果表明擴增得到的片段位于１ ０００～２ ０００ ｂｐ處，與預期目的片段１ ５００ ｂｐ大小基本相符。將ＰＣＲ擴增產物回收并連接到ｐＭＤ１８－Ｔ載體上，然后轉化Ｔｏｐ１０感受態細胞，在含有１００ ｍｇ／Ｌ Ａｍｐ的ＬＢ平板上篩選陽性轉化子，然后進一步通過ＰＣＲ和酶切鑒定檢測其中的陽性克隆，并進行測序。

２．５菌株ＺＡ－０５內切-β-1，4-葡聚糖酶編碼基因的序列分析

經測序得到的內切-β－１，４-葡聚糖酶基因（ｅｇｌ）序列如圖５。該基因片段含有一個具有１ ５００個核苷酸的開放閱讀框架，在ＧｅｎＢａｎｋ中進行序列比較，該序列同淀粉液化芽孢桿菌ＰＳＭ ３．１的ｅｇｌＩＩ基因（ＧＵ３９０４６３）核苷酸序列同源性達到９７．６0％。共編碼氨基酸４９９個，計算的理論分子量約５５ｋＤａ，其序列同已發表的纖維素酶氨基酸序列（ＣＡＥ１１２４３．１）同源性為９６．１９％。

３討論

目前研究的纖維素酶產生菌一般是木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）和曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等，產生的纖維素酶通常為酸性酶，最適ｐＨ為３～５，在堿性環境下無活性或活性很低［５，６］。該研究成功分離到一株堿性纖維素降解菌ＺＡ－０５，經鑒定為淀粉液化芽孢桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）。在堿性條件下，菌株ＺＡ－０５仍能繼續生長并表現出較強的內切-β-1，4-葡聚糖酶酶活性。淀粉液化芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，內含很多相同或相似的基因，僅從同源性上很難精確確定它的分類地位。但是這兩個菌種某些相同或相似基因的排列順序不同，可以利用這一差別通過同時鑒定多個基因來區分這兩個菌種［７］。該研究分離的ＺＡ－０５菌株１６ｓ ｒＤＮＡ序列與枯草芽孢桿菌（ＡＢ５０１１１３）相似性達到９９．３４％，結合生理生化測定結果，鑒定其為淀粉液化芽孢桿菌。堿性纖維素酶必須具有下列特性才能作為洗滌用酶：在堿性條件下具有較高的活性，酶催化反應的最適ｐＨ最好大于９．０；可以耐受洗滌劑中的表面活性劑如ＳＤＳ、ＥＤＴＡ等；熱穩定性好，至少能在５０℃保溫３０ ｍｉｎ后活性不發生顯著的變化。該研究分離獲得的菌株ＺＡ－０５在ｐＨ為１０．０的條件下內切-β-1，4-葡聚糖酶活性達到最高，可滿足工業生產的條件之一。該研究通過提取菌株細胞總ＤＮＡ，進行內切-β-1，4-葡聚糖酶基因ＰＣＲ擴增和序列測定，可為淀粉液化芽孢桿菌內切-β-1，4-葡聚糖酶基因高效表達載體的構建以及最終降低內切-β-1，4-葡聚糖酶的生產成本提供基礎材料和科學依據。

參考文獻：

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［７］ 劉森林，邢苗，劉剛． 堿性纖維素酶革蘭氏陰性菌株篩選及酶學性質研究［Ｊ］． 微生物學通報，２００５，３２（４）：９１－９４．