植物內(nèi)源激素的分析方法

摘要：綜述了植物內(nèi)源激素的分析方法，主要包括酶聯(lián)免疫吸附測定法、氣相色譜法、高效液相色譜法、光譜法和毛細管電泳法，并對樣品預(yù)處理方法進行了闡述。

關(guān)鍵詞：植物內(nèi)源激素；分析方法；預(yù)處理

中圖分類號：Ｑ９４６．８８５；０６５７文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3681-03

Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Mｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ

ＳＵＮ Ｋｕａｎ－ｙｉｎｇａ，ＣＨＥＮ Ｙａｎｂ

（ａ．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ｂ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ ２５２０５９，Ｓｈａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ， ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ， ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ were reviewed． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ were ａｌｓｏ ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ ｗｅｒｅ forecast．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ； ａｎａｌｙｓｉｓ ｍｅｔｈｏｄ； ｐｒｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ

植物內(nèi)源激素是指一些在植物體內(nèi)合成，并從產(chǎn)生之處運送到其他器官，對生長發(fā)育產(chǎn)生顯著作用的微量（１ μｍｏｌ／Ｌ以下）有機物。其含量雖少，但是每種激素都是不可或缺的，它們同時存在，并且其生理效應(yīng)相互促進，或者相互拮抗。通過這些生理效應(yīng)來調(diào)控植物的生長發(fā)育。植物內(nèi)源激素還作為執(zhí)行細胞通訊的化學(xué)信號，在代謝、生長、形態(tài)建成等植物生理活動的各個方面起著非常重要的作用［１］。目前公認的植物內(nèi)源激素有：生長素（ＩＡＡ）、赤霉素（ＧＡ３）、細胞分裂素（ＣＴＫ）、脫落酸（ＡＢＡ）、乙烯（ＥＴＨ）五大類。近年來，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)在植物體內(nèi)還存在一些對植物生長發(fā)育起到調(diào)節(jié)作用的有機物質(zhì)，如油菜素內(nèi)酯（Ｂｒａｓｓｉｎｏｌｉｄｅ，ＢＲｓ）、茉莉酸（Ｊａｓｍｏｎｉｃ ａｃｉｄ，ＪＡ）、多胺（Ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ，Ｐａｓ）、水楊酸（Ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ＳＡ）等。１９９８年第１６屆國際植物生長物質(zhì)學(xué)會會議上，油菜素內(nèi)酯被確認為植物內(nèi)源激素。植物內(nèi)源激素在植物體內(nèi)的微量活性含量的準確測定，對植物生命活動、遺傳育種及栽培領(lǐng)域的研究具有重要意義，有利于更好地研究和控制其生長發(fā)育進程。因此，選擇最佳植物內(nèi)源激素的測定分析方法顯得尤其重要。

１植物內(nèi)源激素的分析方法

１．１酶聯(lián)免疫吸附測定法（ＥＬＩＳＡ）

酶聯(lián)免疫吸附測定法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ，簡稱ＥＬＩＳＡ）有兩種形式，一種是在固相載體上直接包被抗體（直接法），另一種是包被抗原（間接法）。在ＥＬＩＳＡ中抗原抗體反應(yīng)的檢測依靠酶標記物來實現(xiàn)。常用的酶有辣根過氧化物酶（ＨＲＰ）和堿性磷酸酯酶（ＡＰ）。該分析方法具有靈敏性高，方便、安全、快捷、成本低廉的特點，被廣泛應(yīng)用于植物內(nèi)源激素的測定。目前，幾大類激素都建立了相應(yīng)的ＥＬＩＳＡ方法并有試劑盒出售。覃喜軍等［2］采用ＥＬＩＳＡ，對羅漢果雌株二級蔓上的腋芽進行了植物內(nèi)源激素生長素（ＩＡＡ）、赤霉素（ＧＡ３）、脫落酸（ＡＢＡ）、玉米素核苷（ＺＲ）含量變化的研究。赫冬梅等［3］采用ＥＬＩＳＡ對煙草的內(nèi)源激素（ＩＡＡ）進行了測定。王明林等［4］用酶聯(lián)免疫吸附測定法分析棉纖維中的ＧＡ３，試驗表明該方法分析棉纖維中的ＧＡ３是可行的，符合分析的要求。此方法存在眾多優(yōu)點的同時也有缺陷，如重演性差，特異性取決于抗原的制備等。因此，還需要進一步研究改進，加以完善。

１．２氣相色譜法（ＧＣ）

氣相色譜法（Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，簡稱ＧＣ）是色譜法的一種。ＧＣ適用所有植物內(nèi)源激素的分離和定量測定，具有選擇性強、靈敏度高、分離性能好、分析速度快等優(yōu)點。付磊等［5］采用５３０ μｍ大口徑毛細管色譜柱、不經(jīng)衍生化處理而直接測定草莓中ＧＡ３ 的氣相色譜方法。該方法還適用于蘋果、柑橘、桃、菠蘿以及黃瓜等樣品分析，且均取得了理想的結(jié)果。杜黎明等［6］應(yīng)用大口徑毛細管氣相色譜法，以正二十二烷為內(nèi)標物， 對植物組織中的ＩＡＡ、ＡＢＡ和ＧＡ３ ３ 種內(nèi)源激素進行了測定，并獲得了較高的回收率。劉志勇等［7］用大口徑毛細管氣相色譜法快速測定豆芽組織中的ＧＡ３，結(jié)果令人滿意。近年來ＧＣ－ＭＳ聯(lián)用技術(shù)為植物內(nèi)源激素檢測分析提供了一個更新的平臺。Ｂｉｒｋｅｍｅｙｅｒ等［8］采用ＧＣ－ＥＩ－ＭＳ對煙草根中的ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＪＡ、ＳＡ進行了測定。Ｋｏｏｙ等［9］硅烷化試劑衍生后用ＧＣ－ＭＳ對ＩＡＡ、ＪＡ、ＳＡ進行了測定，此方法可用于百合、玫瑰中植物內(nèi)源激素的定量分析。許多試驗結(jié)果證實，ＧＣ－ＭＳ聯(lián)用技術(shù)選擇性好、靈敏度高、定性能力強等，但是在具體操作過程中樣品純化程序復(fù)雜，還需要衍生化處理，所需設(shè)備昂貴，使用和維護成本相對較高。

１．３高效液相色譜法（ＨＰＬＣ）

高效液相色譜法（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，簡稱ＨＰＬＣ）是色譜法的一個重要分支。該法以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。與ＧＣ相似，ＨＰＬＣ方法具有靈敏度和選擇性高，重復(fù)性好等優(yōu)點。楊彤等［１0］利用ＨＰＬＣ法測定竹筍中ＧＡ３的含量，測試條件為不銹鋼柱（０．３９ cm × ３０ ｃｍ），Ｃ１８反相色譜填料，柱溫３５ ℃，流動相４０％醇溶液，流速１．５ ｍL／ｍｉｎ，多功能可變波長檢測器，檢測波長２００ ｎｍ。喬坤云等［１1］利用該法測定新疆庫爾勒香梨中的ＧＡ３，測試條件為Ｃ１８分析柱，改變柱溫分別為３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５ ℃，流動相甲醇與０．０１ ｍｏｌ／Ｌ磷酸體積比２０∶８０（Ｖ／Ｖ），流量１．２ ｍＬ／ｍｉｎ，紫外檢測器，檢測波長２１０ ｎｍ。趙小菊等［１2］利用ＨＰＬＣ法測定長春花ＧＡ３、ＩＡＡ、ＡＢＡ含量，測試條件為Ｈｉｑｓｉｌ Ｃ１８ 柱（４．６ ｍｍ × ２５０ ｍｍ，５ μｍ），柱溫４０ ℃，流動相甲醇與乙酸溶液體積比５４∶０．８混合液（ｐＨ ３．５），流速１．０ ｍL／ｍｉｎ，二極管陣列檢測器，檢測波長２５４ ｎｍ。劉志勇等［１3］采用反相高效液相色譜法（ＨＰＬＣ）切換波長法同時測定油菜中的內(nèi)源激素ＧＡ３、ＩＡＡ和ＡＢＡ，以甲醇∶水∶乙腈（體積比２０∶６０∶２０）為流動相。顯著減低了各組分的檢出限，建立了一種以高靈敏度對多組分體系進行同時檢測的方法。以上實例中，ＨＰＬＣ法測定植物內(nèi)源激素均取得了較理想的結(jié)果。但是ＨＰＬＣ法也存在一些弊端。它對樣品前處理要求較高，若達不到所需純度要求，可能會出現(xiàn)多種化合物的保留時間相同或接近而影響測定結(jié)果。

１．４光譜法

光譜法（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）是基于物質(zhì)與輻射能作用時，測量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級之間的躍遷而產(chǎn)生的反射、吸收或散射輻射的波長和強度進行分析的方法。熒光分析法具有選擇性好、取樣少、靈敏度高以及簡便快速等優(yōu)點，是進行痕量、超痕量甚至分子水平上分析的重要手段，近年來在植物內(nèi)源激素分析中得到廣泛應(yīng)用。吳翚等［14］發(fā)現(xiàn)ＡＢＡ加入濃硫酸并在沸水中加熱后，體系會發(fā)射較強的熒光（激發(fā)波長３７３ ｎｍ，發(fā)射波長４９０ ｎｍ），并建立了ＡＢＡ的熒光分析法。隨后黃春芳等［15］建立了多元校正不經(jīng)分離同時測定ＮＡＡ和ＩＡＡ兩組分的新方法。徐文婷等［16］利用同步－導(dǎo)數(shù)固體基質(zhì)室溫磷光光譜法對黃瓜、豆芽和西紅柿中的ａ－萘乙酸和６－芐氨基嘌呤進行了測定，并取得理想結(jié)果。光譜法操作簡單，適合微量檢測，但準確度不高。

１．５毛細管電泳法（ＣＥ）

毛細管電泳（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，簡稱ＣＥ）又稱高效毛細管電泳（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＨＰＣＥ），它是一種以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)，是分析科學(xué)繼高效液相色譜法之后的又一重大進展。該法具有分辨率高、靈敏度高、分析對象廣、分析速度快、試樣用量低、儀器簡單、成本低廉、綠色環(huán)保等優(yōu)點，近幾年來得到了廣泛應(yīng)用。鄭冰等［17］用甲醇加鹽酸提取了香蕉葉中的生長素ＩＡＡ、ＩＢＡ、６－ＢＡＰ 及ＧＡ３、ＧＡ４用ＣＥ進行了定量分析。１０ ｍｉｎ內(nèi)完成上述５組分的分離，分離效率為５×１０５～２．６×１０６，５組分檢出限為４．５～１８ ｍｇ／Ｌ；遷移時間與峰高定量精度分別低于１．２％和２．４％。Ｌｉｕ等［18］采用了一種大體積進樣的在線富集方法來提高ＣＥ檢測７種植物激素的靈敏度（包括ＫＴ和ＢＡＰ），該方法可以使分析物實現(xiàn)６０～１００倍的富集。劉群燕等［19］利用ＨＰＣＥ對人工傾斜的中林４６ 楊［Ｐｏｐｕ ｌｕｓ ｅｕｒａｍｅｒｉｃａｎａ （Ｄｏｄｅ） Ｇｕ ｉｎｅｒＣＬ． Ｚｈｏｎｇ ｌｉｎ－４６］樹干形成層內(nèi)源激素（ＧＡ３、ＩＡＡ、ＩＢＡ、ＺＴ、ＡＢＡ）進行測定，得出最佳條件為：電壓１６ ｋＶ、柱溫２０ ℃、緩沖液ｐＨ值 ９．２５、ＳＤＳ 濃度５０ ｍｍｏｌ／Ｌ，５種內(nèi)源激素的回收率為９３％～１０５％。

２樣品預(yù)處理方法

２．１提取

對極性植物內(nèi)源激素，樣品提取前首先要根據(jù)“相似相溶”選擇合適的提取劑，但要注意提取劑不能與樣品發(fā)生反應(yīng)，毒性要低。對非極性的植物內(nèi)源激素，可以用非極性溶劑來提取，也可用混合溶劑來提取。常用的提取劑有甲醇、丙酮、乙醇、乙腈以及混合溶劑等。宋平等［20］指出成熟的組織材料以甲醇提取最好。目前，體積分數(shù)為８０％的甲醇也是最常用的提取劑。張慧等［21］采用８０％甲醇提取蘋果樣品中的赤霉素、甲萘威、脫落酸、多效唑、烯效唑，這５種化合物在甲醇中溶解度高，可以保證較高的提取率。于玉梅等［22］用８０％甲醇加抗氧化劑二乙基二硫代氨基甲酸鈉浸提過夜，提取了黃瓜果實內(nèi)ＺＴ、ＧＡ３、ＩＡＡ及ＡＢＡ，加入抗氧化劑主要是為防止激素分解。Ｓｈｉｇｅｙｕｋｉ［23］用丙酮作為提取劑，用ＧＣ－ＭＳ檢測日本西部地區(qū)水果和蔬菜中的乙烯利含量。劉艷琴等［24］用５０％乙腈水溶液（ｐＨ ２．５）提取水果蔬菜中的ＧＡ３。乙腈本身毒性很大，對人體和環(huán)境都具有一定的危害性，在提取植物激素上應(yīng)用較少。目前已開始采用超聲波提取法，該法操作簡便，是一種快速高效的植物內(nèi)源激素提取方法。

２．２凈化

凈化的目的是除去提取液中的干擾物質(zhì)。常采用的方法有液—液分離法、吸附柱層析法、薄層層析法、離子交換層析法、高壓液相色譜柱凈化法等。

液—液分離法是有機溶劑在特定pＨ條件下，由于密度不同而分層的特性萃取所需的物質(zhì)。陳波浪等［25］用８０％的冷甲醇溶液浸提棉株樣品后，依次用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇對提取液進行萃取凈化，進行ＨＰＬＣ分析。液—液萃取存在的缺點是所需的溶劑量大，凈化時間長，且所用溶劑有毒性。

吸附柱層析法是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構(gòu)成柱的一種層析方法，它具有節(jié)約溶劑、簡單快速、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點。常用的萃取柱為Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８柱、Ｃｅｐ－Ｐａｋ－Ｃ１８柱、混合模式的ＯａｓｉｓＭＣＸ柱等。王水良等［26］選用Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８固相萃取小柱富集馬尾松內(nèi)源激素，再經(jīng)流動相洗脫預(yù)處理，內(nèi)源激素的回收率達到８８．４％～１０８．３％。楊柏云等［27］用Ｓｅｐ-Ｐａｋ Ｃ１８小柱富集百合鱗莖中的內(nèi)源激素，以色譜純甲醇０．０５ ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．０的磷酸鹽緩沖液（體積比為４０∶６０）溶液洗脫后定容至１０ ｍＬ進行ＨＰＬＣ分析。目前層析柱聯(lián)用得到了應(yīng)用，它能提高純化效率。陳建華等［28］從板栗中提取ＩＡＡ、ＧＡ３、ＺＴ和ＡＢＡ等內(nèi)源激素，將提取液離心之后，取上清液經(jīng)過聚乙烯聚吡咯烷酮（ＰＶＰＰ）柱和二乙基氨基乙基交聯(lián)葡聚糖凝膠（ＤＥＡＥＳｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５）柱凈化后，再用Ｓｅｐ－Ｐａｋ Ｃ１８小柱收集樣品中的內(nèi)源激素，最后用５０％的甲醇水溶液洗脫后進行ＨＰＬＣ分析，其回收率達８９．６０％～１０１．５４％，大大簡化了預(yù)處理操作程序，提高了回收效率。

薄層層析法（ＴＬＣ）是將固定相與支持物制作成薄板或薄片，流動相流經(jīng)該薄層固定相而將樣品分離的層析系統(tǒng)。它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點。特別適用于揮發(fā)性較小或在較高溫度不易發(fā)生變化的物質(zhì)的分析。ＴＬＣ法的關(guān)鍵因素之一是選取合適的展開劑。但是ＴＬＣ法步驟繁瑣，僅適用于少量樣品的分離。離子交換層析法（ＩＥＣ）是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。Ｖｒｅｍａｎ等［29］提出了通過陽離子交換純化ＣＴＫ的方法。

３小結(jié)

目前在分析化學(xué)和食品科學(xué)上應(yīng)用廣泛的是高效液相色譜法和氣相色譜法。但是在農(nóng)學(xué)上，主要還是應(yīng)用操作繁瑣的酶聯(lián)免疫法。本研究總結(jié)了對植物內(nèi)源激素的提取、檢測方法，以期為今后關(guān)于植物內(nèi)源激素分析的研究工作提供一定的參考。同時，還要關(guān)注國外先進分析技術(shù)的發(fā)展趨勢，以便不斷改進和提高國內(nèi)的分析水平。

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