宏基因組技術(shù)在篩選未培養(yǎng)微生物中新型酶的研究進(jìn)展

摘要：介紹了宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建及酶基因的篩選方法，對(duì)瘤胃、土壤及其他環(huán)境中微生物宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建和酶基因的篩選研究進(jìn)行了綜述，同時(shí)就宏基因組技術(shù)在未培養(yǎng)微生物研究中的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：宏基因組；新型酶；未培養(yǎng)微生物

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｑ７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０11）18－3673-04

Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ in Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｎｅｗ Ｅｎｚｙｍｅｓ from Ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ

ＪＩＡＮＧ Ｈａｉ－ｑｉｎ１，ＦＡＮ Ｃａｉ－ｙｕｎ２，ＬＩ Ｌü－ｍｕ１，ＣＨＥＮＧ Ｊｉａｎ－ｂｏ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ２３００３６， Ｃｈｉｎａ；

２．Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ were described， ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｔｒｕｄｉｅｓ ｏｆ ｒｕｍｅｎ，ｓｏｉｌ ａｎｄ ｅｘｔｒｅｍｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎ ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ； ｅｎｚｙｍｅ； ｕｎｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ

自然界中大多數(shù)微生物不能通過(guò)傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)獲得其純培養(yǎng)，從而導(dǎo)致環(huán)境微生物中的多樣性基因資源難以被發(fā)現(xiàn)［１］。近年發(fā)展起來(lái)的宏基因組學(xué)技術(shù)，是繼純培養(yǎng)技術(shù)、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)之后的一門(mén)新技術(shù)，它是通過(guò)直接提取特定環(huán)境中全部微生物的總基因組ＤＮＡ，并克隆到適宜的微生物宿主中，然后篩選出目的克隆與基因的方法。構(gòu)建宏基因文庫(kù)是開(kāi)發(fā)未培養(yǎng)微生物基因資源的一條有效途徑。

１宏基因組技術(shù)研究方法

１．１樣品總ＤＮＡ的提取

樣品總ＤＮＡ的提取方法有：直接提取法［２］與間接提取法［３］。直接提取法是將樣品直接懸浮于裂解緩沖液中，然后再提取。此方法簡(jiǎn)便，成本較低，但由于機(jī)械損傷較大，因而所獲得的片段較小。間接提取法是采用較溫和的方法，將分離出來(lái)的菌體用低熔點(diǎn)瓊脂糖等包埋來(lái)進(jìn)行ＤＮＡ的提取。該方法可以獲得片段較大的ＤＮＡ，但是成本高，可能會(huì)在微生物分離時(shí)有丟失的現(xiàn)象。

１．２宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建

構(gòu)建文庫(kù)的關(guān)鍵在于選擇適宜的載體和宿主。根據(jù)所需構(gòu)建的文庫(kù)基因片段大小，載體大致分為３種：①適用于克隆片段小于１０ ｋｂ及單基因的克隆和表達(dá)，如ｐＵＣ１９。②適用于插入片段在４０ ｋｂ左右，如ｃｏｓｍｉｄ、ｆｏｓｍｉｄ。可以獲得多基因簇調(diào)控的微生物活性物質(zhì)的代謝途徑。③適用于外源片段為５０～３００ ｋｂ，如ＢＡＣ。該載體攜帶大量外源基因，可以發(fā)現(xiàn)更多的功能基因及更復(fù)雜的代謝途徑。依據(jù)轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主中宏基因的表達(dá)等因素來(lái)選擇適宜的宿主。目前已經(jīng)構(gòu)建的宏基因文庫(kù)所用的廣泛性宿主均為Ｅ． ｃｏｌｉ，另外假單胞菌、鏈霉菌也可以作為宿主。

１．３宏基因組文庫(kù)的篩選

基于序列的篩選：用已知功能基因的保守序列來(lái)設(shè)計(jì)雜交探針或ＰＣＲ引物，再通過(guò)雜交或 ＰＣＲ擴(kuò)增篩選宏基因組文庫(kù)，獲得目標(biāo)片段序列。其優(yōu)點(diǎn)是適用于具有保守序列的功能基因的篩選、鑒定分類(lèi)學(xué)標(biāo)記的序列分析［４］。其缺點(diǎn)是必須對(duì)相關(guān)功能基因序列有一定的了解并且目標(biāo)基因有一定的保守區(qū)域，所以較難發(fā)現(xiàn)新型的活性基因， 也很難獲得其全序列，篩選出來(lái)的基因相似性比較高。

基于功能的篩選：功能驅(qū)動(dòng)的宏基因組文庫(kù)的篩選是依據(jù)文庫(kù)中的一些陽(yáng)性克隆能表達(dá)的性狀這一特性來(lái)進(jìn)行篩選，利用其在特定篩選培養(yǎng)基上的表觀特性進(jìn)行篩選［３］。先獲得具有生物活性的陽(yáng)性克隆，再進(jìn)行亞克隆鑒定，然后通過(guò)對(duì)插入序列片段的測(cè)序和生物學(xué)分析，從而獲知相應(yīng)的基因信息。其優(yōu)點(diǎn)是可用于檢測(cè)酶的新基因或獲取新的生物活性物質(zhì)。其缺點(diǎn)是陽(yáng)性克隆的篩選主要依賴(lài)于功能基因在宿主菌中的表達(dá)，而很多異源基因在特定宿主中表達(dá)效率不是很高，從而會(huì)導(dǎo)致篩選工作的失敗。

２宏基因組技術(shù)與新型酶篩選

２．１瘤胃微生物宏基因組文庫(kù)構(gòu)建及新型酶基因的篩選

目前，國(guó)內(nèi)外已構(gòu)建牛、羊等反芻動(dòng)物瘤胃微生物宏基因組文庫(kù)，已篩選出多種酶基因（表１）。

２．２土壤宏基因組文庫(kù)構(gòu)建及新型酶基因的篩選

土壤中含有豐富的微生物資源，宏基因組技術(shù)將會(huì)推動(dòng)人們對(duì)土壤微生物的代謝、多樣性的研究。到目前為止，土壤宏基因組技術(shù)在新型酶篩選方面已得到廣泛運(yùn)用（表２）。

２．３其他環(huán)境宏基因組文庫(kù)構(gòu)建及新型酶基因的篩選

除上述環(huán)境外，還有許多環(huán)境都包含著許多不被人所知的微生物，如極端環(huán)境、海綿、表面水、人的唾液等；宏基因組技術(shù)能幫助人們有效地認(rèn)識(shí)微生物，同時(shí)獲得更多的新型酶，將其廣泛應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中（表３）。

３展望

宏基因組學(xué)技術(shù)利用免培養(yǎng)方法，改變了以往微生物純培養(yǎng)技術(shù)的弊端，為全面調(diào)查和挖掘未培養(yǎng)微生物的多樣性及開(kāi)發(fā)利用其資源提供了一種有效手段。利用宏基因組技術(shù)篩選新型酶基因被證實(shí)是一種行之有效的方法，在新型的工業(yè)用酶及生物活性物質(zhì)的篩選等方面，效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他方法，并且具有廣闊的前景，是基因工程研究的一個(gè)主要方向［４５］。宏基因組技術(shù)使分子生物產(chǎn)業(yè)投入到工業(yè)應(yīng)用中，為工業(yè)的發(fā)展提供了一個(gè)前所未有的機(jī)遇［４６］。但是該技術(shù)在篩選新型酶的應(yīng)用中還存在不足之處。比如總ＤＮＡ提取中會(huì)有部分片段丟失；篩選的技術(shù)需要改進(jìn)：對(duì)于序列分析法來(lái)說(shuō)，測(cè)序的速度和費(fèi)用的問(wèn)題對(duì)該技術(shù)的影響還比較大。功能分析法需要高通量的篩選方法，其中最重要的是提高異源基因的表達(dá)和從巨大的文庫(kù)中有效地篩選目標(biāo)克??；篩選酶時(shí)依賴(lài)于宿主表達(dá)，有些酶也許為胞內(nèi)酶，無(wú)法釋放到胞外，有些酶分泌過(guò)多會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，需要不斷探索和改進(jìn)。

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