熱水浸提法提取鐵皮石斛原球莖多糖的工藝

摘要：利用正交試驗對鐵皮石斛原球莖多糖提取的工藝條件進行優(yōu)化，考察料水質(zhì)量比、浸提溫度、浸提時間和浸提次數(shù)４個因素對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響。結(jié)果表明，鐵皮石斛原球莖多糖的最佳提取工藝為浸提次數(shù)４次，浸提時間３ ｈ，料水質(zhì)量比１∶６０，浸提溫度８０ ℃，多糖得率為９．１７％。在４個提取因素中，對鐵皮石斛原球莖多糖提取影響最大的因素是浸提次數(shù)，其次是浸提時間，料水質(zhì)量比和浸提溫度影響都比較小，其中浸提次數(shù)不同水平間呈極顯著差異，浸提時間、料水質(zhì)量比和浸提溫度對鐵皮石斛原球莖多糖提取率影響不顯著。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；原球莖；多糖；提取工藝

中圖分類號：Ｒ２８４．２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０11）18－3807-04

Hot Water Extraction Technology for Polysaccharides from Protocorms of

Dendrobium candidum

ＣＥＮ Ｚｈｏｎｇ－ｙｏｎｇ，ＳＵ Ｊｉａｎｇ，ＬＩＡＮＧ Ｇｕａｎ－ｘｉｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｈｅｃｈｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙｉｚｈｏｕ ５４６３００，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ ｔｏ ｗａｔｅｒ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ and ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｏ ｇｅｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅs ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｏｃｏｒｍｓ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ ｂｙ ｈｏｔ ｗａｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： Tｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ ｔｏ ｗａｔｅｒ １∶６０， ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｆｏｕｒ ｔｉｍｅｓ ａｔ ８０℃ ｆｏｒ ３ｈ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅs ｗａｓ ９．１７％． Ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｆａｃｔｏｒｓ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒ， ｔｈｅ ｎｅｘｔ ｗａｓ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ ｔｏ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗere ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｅｓｓ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ， ｗｈｉｌｅ ｔｈａｔ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ； ｐｒｏｔｏｃｏｒｍｓ； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ

鐵皮石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ cａｎｄｉｄｕｍ）屬于蘭科石斛屬（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ），其主要藥效成分為多糖，具有較強的抗腫瘤、增強免疫功能活性、清胃熱、助消化等功能，鐵皮石斛作為傳統(tǒng)的中藥材，其價值已被世人所公認和推崇［１－７］。鐵皮石斛的種子極小、無胚乳，自然條件下需與某些真菌共生才能萌發(fā)，很難用實生苗栽培，而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率極低，加上人為的過度采挖和破壞生境，野生鐵皮石斛瀕臨滅絕［８，９］。為保護珍貴野生資源和滿足市場需求，采用組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)獲得鐵皮石斛成為一種科學(xué)的解決方案。目前，鐵皮石斛試管苗的繁殖一般要經(jīng)過原球莖（Ｐｒｏｔｏｃｏｒｍ）階段，而類原球莖實質(zhì)上是正在生長分化的體細胞胚胎，具有植株同樣的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育的潛能。目前，利用組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)鐵皮石斛原球莖已獲得成功，使用原球莖代替全植株作為藥源成為可能。

由于多糖是鐵皮石斛的主要藥用成分，因此，多糖的提取是人們利用鐵皮石斛的重要環(huán)節(jié)之一。為了進一步探索鐵皮石斛多糖提取的方法，充分發(fā)揮鐵皮石斛的作用，研究了熱水浸提法在鐵皮石斛原球莖多糖提取中應(yīng)用的可行性，考察影響提取的主要因素，尋求最佳的提取工藝條件，為研究鐵皮石斛原球莖多糖及其藥理作用提供理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１材料

原料：取培養(yǎng)于１／２ＭＳ固體培養(yǎng)基的鐵皮石斛原球莖，先在１０５ ℃干燥箱中烘２０～３０ ｍｉｎ，再于６０～８０ ℃烘干后，經(jīng)粉碎、干燥恒重處理后備用。

試劑： 苯酚（ＡＲ）、濃硫酸（ＡＲ）、８０％乙醇和９５％乙醇（ＡＲ）、石油醚（ＡＲ）、葡萄糖（ＡＲ）。

儀器： ＵＶ－１８００ 型分光光度計（日本島津公司），索氏提取器（江蘇金壇醫(yī)療儀器廠），ＨＨ－６恒溫水浴鍋（鄭州杜甫儀器廠），ＡＥ２４０Ｓ型電子分析天平［梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司］， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器ＲＥ－５２ＡＡ（上海亞榮生化儀器廠）。

１．２試驗方法

１．２．１標準曲線的制作準確稱取１００ ｍｇ葡萄糖，以去離子水溶解并定容至１００ ｍＬ，此時葡萄糖濃度為１ ｍｇ／ｍＬ。精確量取葡萄糖標準工作液（１ ｍｇ／ｍＬ）０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０ ｍＬ，分別置于試管中，各加去離子水使成２ ｍＬ，則各管中葡萄糖的濃度分別為０．０５、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０ ｍｇ／ｍＬ。在上述各管中加苯酚試劑（１０ ｇ蒸餾苯酚溶于１５０ ｇ去離子水）１ ｍＬ，搖勻，迅速滴加濃硫酸５．０ ｍＬ，并迅速搖勻，靜置５ ｍｉｎ，沸水浴１５ ｍｉｎ，取出，流動水冷卻至室溫，另以２ ｍＬ去離子水同樣操作，作空白對照，用ＵＶ－１８００紫外分光光度計在４９０ ｎｍ處測定吸光度。以葡萄糖濃度Ｃ為橫坐標，吸光度Ａ為縱坐標，制作標準曲線并得其回歸方程為Ａ＝７．１５０ ７Ｃ－０．０３４ ７（ｒ＝０．９９９ ５），根據(jù)回歸方程可計算出樣品溶液中葡萄糖的濃度。

１．２．２鐵皮石斛原球莖多糖的提取與精制參照李滿飛等［１０］的方法并作了改良，準確稱取鐵皮石斛原球莖干品粗粉１５ ｇ，用濾紙和脫脂紗布包好，先經(jīng)石油醚（６０～９０ ℃）在索氏提取器中于８５ ℃的水浴中回流脫脂１．５ ｈ，再用８０％乙醇在９５ ℃水浴中回流３.0 ｈ（提取分離干擾組分），取出濾紙包置于６０ ℃烘干箱中烘干，然后用細口瓶將濾紙包里面的原球莖樣品沖洗至１５０ ｍＬ的圓底燒瓶中，加入１００ ｍＬ去離子水，于沸水浴中提取２次，３ ｈ/次，趁熱過濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至５０ ｍＬ后，加入少量活性炭進行脫色，過濾，濾液加４倍量９５％乙醇混合，靜置過夜，離心，沉淀用５０ ｍＬ去離子水溶解重復(fù)醇沉１次。過濾沉淀用９５％乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌，在烘箱中６０ ℃烘干，即得鐵皮石斛粗多糖。

１．２．３換算因子的測定精確稱取干燥的鐵皮石斛多糖１００ ｍｇ，放入１００ ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，取１０ ｍＬ于１００ ｍＬ容量瓶中，定容至刻度，搖勻。配制成０．１ ｍｇ／ｍＬ的多糖溶液備用。吸取該多糖溶液０．５ ｍＬ，加去離子水至２.0 ｍＬ，按標準曲線的制作方法操作，測定吸光度。按測定標準曲線的方法測其吸光度。按下式計算換算因素：

Ｆ＝Ｃ／Ｃ１Ｄ

其中，Ｃ為多糖濃度（μｇ／ｍＬ）；Ｃ１為多糖中葡萄糖的濃度（μｇ／ｍＬ）；Ｄ為鐵皮石斛多糖的稀釋倍數(shù)，測得Ｆ＝１．４９。

１．２．４鐵皮石斛原球莖多糖的測定多糖含量采用苯酚－濃硫酸的方法進行測定［１０］。準確稱取鐵皮石斛原球莖干品粗粉１．０００ ｇ用濾紙和脫脂紗布包好，先經(jīng)石油醚（６０～９０ ℃）在索氏提取器中于８５ ℃的水浴中回流脫脂１．５ ｈ，再用８０％乙醇在９５ ℃水浴中回流３ ｈ（提取分離干擾組分），取出濾紙包置于６０ ℃烘干箱中烘干，然后用細口瓶將濾紙包里面的原球莖樣品沖洗至１５０ ｍＬ的圓底燒瓶中，按照提取的設(shè)定條件于水浴中提取，趁熱過濾，收集濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至５０ ｍＬ后，將濃縮液移入１００ ｍＬ容量瓶中，定容，搖勻，即得鐵皮石斛原球莖多糖溶液。精密吸取樣品液２．５ ｍＬ于２５ ｍＬ容量瓶中，定容，搖勻，取１．０ ｍＬ置于試管中，加去離子水補足至２．０ ｍＬ，加苯酚試劑１．０ ｍＬ混勻，迅速滴加濃硫酸５．０ ｍＬ，并迅速混勻，放置５ ｍｉｎ，于沸水浴中加熱１５ ｍｉｎ后，取出，流水冷卻，然后按１．２．１中的方法測定吸光度，由回歸方程計算出樣品溶液葡萄糖的濃度。按以下公式計算樣品中的多糖含量：

多糖含量（％）＝［（Ｃｓ×Ｄ×F×Ｖ）／Ｗ］×１００%

式中，Ｃｓ為樣品溶液中葡萄糖的濃度（μｇ／ｍＬ），Ｄ為樣品溶液的稀釋倍數(shù)，Ｖ為樣品溶液的體積（ｍＬ），Ｆ為換算因子，Ｗ為樣品的質(zhì)量（ｇ）。

１．２．５單因素試驗

１）料水質(zhì)量比對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響。在恒定溫度為８０ ℃，浸提時間為３ ｈ，浸提次數(shù)為１次的條件下，分別設(shè)料水質(zhì)量比（指鐵皮石斛原球莖干品粗粉與水的質(zhì)量比）為１∶４０、１∶５０、１∶６０、１∶７０進行提取，并計算鐵皮石斛原球莖多糖得率。

２）浸提溫度對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響。在恒定料水質(zhì)量比為１∶５０，浸提時間為３ ｈ，浸提次數(shù)為１次的條件下，分別設(shè)浸提溫度為７０、８０、９０、１００ ℃進行提取，并計算鐵皮石斛原球莖多糖得率。

３）浸提時間對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響。在恒定料水質(zhì)量比為１∶５０，浸提溫度為８０ ℃，浸提次數(shù)為１次的條件下，分別設(shè)浸提時間為１、２、３、４ ｈ進行提取，并計算鐵皮石斛原球莖多糖得率。

４）浸提次數(shù)對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響。在恒定料水質(zhì)量比為１∶５０，浸提溫度為８０ ℃，浸提時間為３ ｈ，分別設(shè)浸提次數(shù)為１、２、３、４次進行提取，并計算鐵皮石斛原球莖多糖得率。

１．２．６正交試驗設(shè)計在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用正交試驗對鐵皮石斛原球莖多糖浸提溫度、浸提時間、浸提次數(shù)和料水質(zhì)量比進行優(yōu)化，選用正交試驗表Ｌ９（３４）對鐵皮石斛原球莖多糖提取工藝進行正交試驗設(shè)計。

２結(jié)果與分析

２．１單因素試驗結(jié)果與分析

２．１．１料水質(zhì)量比對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響由圖１可知，料水質(zhì)量比從１∶４０到１∶５０水平中，鐵皮石斛原球莖多糖得率迅速上升，即從５．８１％上升到８．３８％，增加幅度為２．５７個百分點。但是在料水質(zhì)量比從１∶５０到１∶７０水平，鐵皮石斛原球莖多糖得率上升緩慢，增加幅度僅為０．４１個百分點。從實際生產(chǎn)成本綜合考慮，認為選取料水質(zhì)量比為１∶６０為佳。

２．１．２浸提溫度對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響由圖２可知，在浸提溫度為７０ ℃時，鐵皮石斛原球莖多糖得率為６．３８％；浸提溫度為８０ ℃時，鐵皮石斛原球莖多糖得率迅速上升，為７．４９％；當浸提溫度從８０ ℃上升到１００ ℃時，多糖得率仍呈上升趨勢，但上升比較緩慢，提高幅度為０．８３個百分點。從實際生產(chǎn)成本和能源損耗方面考慮，認為選擇浸提溫度為９０ ℃較適宜。

２．１．３浸提時間對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響由圖３可知，當浸提時間為１ ｈ時，鐵皮石斛原球莖多糖得率較低，為４．７０％；當浸提時間為２ ｈ時，鐵皮石斛原球莖多糖得率有較大幅度的提高，為６．３９％，提高了１．６９個百分點；當浸提時間為３ ｈ和４ ｈ時，鐵皮石斛原球莖多糖得率仍上升，分別為８．４８％和８．７３％，但３ ｈ后上升緩慢。從實際生產(chǎn)效率與成本的要求考慮，認為選擇最適宜浸提時間不宜超過３ ｈ。

２．１．４浸提次數(shù)對鐵皮石斛原球莖多糖得率的影響由圖４可見，浸提２次和３次鐵皮石斛原球莖多糖得率增加明顯，得率分別為６．６１％和８．３０％，比浸提１次和2次的分別增加１．４０和１．６９個百分點。浸提超過３次以后，鐵皮石斛原球莖多糖得率盡管有所增加，但是增加得很少，僅有０．５８個百分點。從生產(chǎn)成本的角度考慮，浸提次數(shù)不應(yīng)超過３次。

２．２正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗分析結(jié)果，采用Ｌ９（３４）正交試驗來優(yōu)化提取工藝條件。試驗因素及水平見表１，試驗結(jié)果和分析見表２。由表２可知，４個提取因素對鐵皮石斛原球莖多糖得率影響的大小順序為浸提次數(shù)＞浸提時間＞料水質(zhì)量比＞浸提溫度；方差分析結(jié)果表明，浸提次數(shù)各水平間差異呈極顯著水平，浸提溫度、浸提時間和料水質(zhì)量比對鐵皮石斛原球莖多糖得率影響不顯著。因此，選取各因素的最佳組合為Ａ２Ｂ１Ｃ２Ｄ３，即在溫度為８０℃下，以１∶６０的料水質(zhì)量比，浸提３ ｈ，浸提次數(shù)４次為最佳提取工藝組合，此時多糖得率為９．１７％。

３結(jié)論

熱水浸提法中影響鐵皮石斛原球莖多糖得率的主要因素有料水質(zhì)量比、浸提溫度、浸提時間和浸提次數(shù)。在料水質(zhì)量比、浸提溫度、浸提時間和浸提次數(shù)幾個主要影響因素的單因素試驗基礎(chǔ)上，采用正交試驗對熱水浸提法提取鐵皮石斛原球莖多糖工藝條件進行了優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，最佳提取條件為溫度８０ ℃，料水質(zhì)量比１∶６０，浸提時間３ ｈ，浸提次數(shù)４次。在此條件下所得鐵皮石斛原球莖多糖得率為９．１７％，試驗結(jié)果與前人研究結(jié)果相近［１１］。熱水浸提法是傳統(tǒng)的多糖提取方法，這種提取方法成本較低，取材方便，提取條件易于控制，且提取率較高，在工業(yè)化提取鐵皮石斛原球莖多糖上具有廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻：

［１］ 董群，方積年．多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用［Ｊ］．中國藥學(xué)雜志，２００１，３６（１０）：６４９－６５２．

［２］ ＦＲＡＮＺ Ｇ． Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｉｎｐｈａｒｍａｃｙ： ｃｕｒｒｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｃｏｎｃｅｐｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｅｄｉｃａｌ，１９８９，５５：４９３－４９７．

［３］ 楊 虹，王順春，王崢濤，等．鐵皮石斛多糖的研究［Ｊ］．中國藥學(xué)雜志，２００４，３９（４）：２５４－２５６．

［４］ 張中建，閻小偉．鐵皮石斛制劑免疫調(diào)節(jié)作用的實驗研究［Ｊ］．食品研究與開發(fā)，２００４，２５（２）： ３４－３７．

［５］ 何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等．鐵皮石斛原球莖多糖ＤＣＰＰ１ａ－１的理化性質(zhì)及抗腫瘤活性［Ｊ］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，２００７，１９（４）：５７８－５８１．

［６］ 夏春東，廖學(xué)才，李守良．石斛藥用概述［Ｊ］．實用中醫(yī)藥雜志，１９９８，１４（４）：４５－４９．

［７］ 郭勇，程曉磊．石斛在惡性腫瘤治療中的作用［Ｊ］．浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，２００７，１７（７）：４５４－４５８．

［８］ 徐紅，李曉波，王崢濤，等．海南、廣東省石斛屬植物資源與種質(zhì)保護研究［Ｊ］．中國野生植物資源，１９９９（５）：２４－２６．

［９］ 陳立鉆，孫繼軍．珍稀瀕危物種鐵皮石解的保育與開發(fā)利用［Ｊ］．中國林業(yè)，２００３，１１（２２）：３４－３６．

［１０］ 李滿飛，徐國鈞，平田羲正，等．中藥石斛類多糖的含量測定［Ｊ］．中草藥，１９９０，２1（１０）：１０－１２．

［１１］何鐵光，楊麗濤，李揚瑞，等．鐵皮石斛原球莖多糖提取最佳工藝研究［Ｊ］．西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，２００６，１５（５）：２４０－２４３．